Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии а ; именно к получению рекомбинантных антигенов вирусов клещевого энцефалита и гепатита В на основе вируса осповакцины.
Целью изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей одновременно комплекс
структурных генов вируса клеи1евого энцефалита и ген IlKsAg вируса гепатита В и обеспечивающей при встройке в ТК-ген вируса осповакцииы одновре- менную экспрессию кодируемых ими антигенных полипептидов в клетках млекопитающих и организмах животных.
Сконструирована рекомбииантная плазмидная ДНК p7.5S IICHE, обеспепинающей синтез антигенов вирусов клещевого энцефалита и гепатита В, которая состоит из фрагмента генома вируса клещевого энцефалита, фрагмента генома вируса гепатита В, промоторов вируса осповакцины, плазмид- ного вектора, обеспечивающего встройку указанных компонентов в ген тими- динкиназы вируса осповакцины.
Пример 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК p7,5S IICME.
50 мкг ДНК плазмиды р - , содержащей фрагмент ДНК вируса гепатита В, кодирующий IlBsAg, расщепляют Xhol и Ват HI - рестриктазами в реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис-НС1,
Из плазмиды р 311 выделяют BamHI - EcoRI - фрагмент ДНК длиной 2682 п.о., содержащий С, М, Е гены вируса клещевого энцефалита, состыкованные с 11 к
Клон, содержащий в составе вектора pVAR 15 как ген HBsAg (Bainlll фрагмент 1279 п.о.), так и состыкованные с
рН 7,9, 10 мМ 7 мМ р-меркаптоэтанол, по 200 ед. Xhol и BamHI - ре-20промотором и клонируют его в Ват HIстриктаз. Инкубацию осуи4ествляют приEcoRI линеаризованной плазмиде p7,5S.
37°С в течение 1 ч. Xhol - BamHI
фрагмент длиной 1273 п.о., содержащий
ген HBsAg, выделяют после электрофо-
реза методом электроэлюции на диализ-25ц промотором С, М, Е гены (BamHI ную мембрану. Полученный фрагмент ли-EcoRT фрагмент 2682 п.о.) обозначили
гируют с EcoRI, SalGI синтетическимp7,5S IICTfE.
фрагментом ДНК, имеющим следующую днк плазмиды p7,5S I1CME используют для трансформации клеток почек зе30-леной мартышки СУ-1, зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИПВ. Урожай
структуру:
AATTCTGCAGGATCCG .
GACGTCCTAGGCAGCT Так как Sal GI и Xhol-рестриктазы имеют одинаковые липкие концы, то пришивка линкера происходит к SalGl - концу фрагмента 1273 п.о. Гидролиз продуктов сшивки по внутреннему BatnHl-сайту линкера приводит k образованию BamHI фрагмента ДНК длиной 1279 п.о., содержащему ген HBsAg.
вируса после трансформации высевают на монослой перевиваемой линии клеток . В присутствии 25 мкг/мл бром- 35 дезоксиуридина отбирают вирусные клоны, методом ДНК-ДНК гибридизации на фильтрах, проверяют наличие последовательностей ДНК вирусов клещевого энцефалита и гепатита В в клонах, ПоЭтот фрагмент клонируют по BamHI-сай- 40 ложительные по гибридизации клоны на- ту в плазмиде pBR 322 и полученную ращивают на клетках СУ-1 на среде таким образом плазмиду обозначают р,
Из плазмиды р выделяют lianiHI - фрагмент длиной 1279 п.о. и клонируют его в векторе р VAR 15.45
Клоны, содержащие искомый фрагИгла НЕМ с 2 сыворотки новорожденных телят. В пробах, содержащих клеточные лизаты и культуральные жидкости, определяют наличие антигена вируса клещевого энцефалита иммуноферментным методом с пероксидазой хрена, а наличие HBsAG радиоиммунологическим сэндвич-анализом,
мент, идентифицируют методом ДНК - ДНК гибридизации, ориентацию фрагмен та определяют путем ХЬа 1 - гидролиза положительных по гибридизации клонов. Плазмиду, содержащую фрагмент 1279 п.о. в правильной ориентации относительно 7,13к промотора вектора р VAR 15 обозначили p7,5S.
Плазмиду p7,5S гидролизуют в условиях непоиного гидролиза в реакционной смеси, содерн аи(ей 100 мкг/мл ДНК плазмиды p7,5S, 10 м1 трис-НС1 рН 7,5, 10 мИ MgClj, 7 мИ/5-мерклптоэта
нола, 30 ед/мл ianiJll-рестриктазы. Реакцию ведут при ЗУ С 15 мин, после чего действие Bamlit-рестриктазы останавливают прогреванием пробы при 67 С 15 мин, добавляют NaCl до концентрации 100 мМ и ЕсоК1--рестриктазу до концентрации 200 ед/мл. Реакцию расщепления ДНК Cc.oRJ-рестриктазой проводят при в течение 1 ч, после
чего выделяют BamHI-EcoRI - фрагмент ДНК длиной 5723 п.о,, соответствующий по электрофоретической подвижности в 0,7 агарозном геле линейной форме плазмиды p7,5S.
Из плазмиды р 311 выделяют BamHI - EcoRI - фрагмент ДНК длиной 2682 п.о., содержащий С, М, Е гены вируса клещевого энцефалита, состыкованные с 11 к
Клон, содержащий в составе вектора pVAR 15 как ген HBsAg (Bainlll фрагмент 1279 п.о.), так и состыкованные с
EcoRI линеаризованной плазмиде p7,5S.
ц промотором С, М, Е гены (BamHI вируса после трансформации высевают на монослой перевиваемой линии клеток . В присутствии 25 мкг/мл бром- дезоксиуридина отбирают вирусные клоны, методом ДНК-ДНК гибридизации на фильтрах, проверяют наличие последовательностей ДНК вирусов клещевого энцефалита и гепатита В в клонах, Положительные по гибридизации клоны на- ращивают на клетках СУ-1 на среде
Игла НЕМ с 2 сыворотки новорожденных телят. В пробах, содержащих клеточные лизаты и культуральные жидкости, определяют наличие антигена вируса клещевого энцефалита иммуноферментным методом с пероксидазой хрена, а наличие HBsAG радиоиммунологическим сэндвич-анализом,
Во всех опытных пробах был обнаружен антиген вируса клещеоого энцефалита в концентрации 30-60 нг/мл и HBsAg в концентрации 100-300 нг/мл.
Кроликов шиншилл массой 1,52 кг иммунизируют посрр-дстеом скарификации в область спины 1 мл клеточного лиза- та, содержащего рекомб11нэтный вирус оспопакцины в титре 10. Перед началом иммунизации у м:ивотных берут кровь
и проверяют наличие неспецифического связывания с антигенами вирусов клещевого энцефалита и гепатита В.
Образцы крови иммунизированных животных забирают каадые 2 недели по 5 мл из ушной вены. Определение антител против HBsAg проводят твердофазным радиоиммунометримескии способом
ifj с
с использованием меченого I. про- теина А S. Aureus. В лунки планшетьг для иммунологических реакций наносят HBsAg. Наличие специфических антител против HBsAg в испытуемой сыворотке обнаруживают измерением радиоактив- ности меченого 1 протеина Л после последовательной инкубации сыворотки и затем меченого протеина А на планшете с нанесенным антигеном.
Аналогичным образом проводят тес- тирование антител против вируса оспо- вакцины, однако в этом случае в качестве антигена вместо UBsAg используют вирус осповакцины.
Антитела к антигену вируса клеще- вого энцефалита определяют методом dot-blotting в системе трехслойного сэндвича с использованием в качестве антигена высокоочищенного белка оболочки вируса КЭ, сорбирован- ного на нитроцеллюлозных фильтрах, выявление специфических антител производят с помощью маркированного пер- оксидазой протеина А. Из 5 иммунизированных кроликов у k кроликов проис- ходила индукция антител против вируса осповакцины, при этом у двух кроликов из четырех образовывались антитела против антигена вируса кпещееосодержащий ген ампициллиярезист :-н; - ности и участок иницилц - ре(я;:.Г;иии
-Hind III - Fu-.oR I сирагмеит /{НК вируса осповакцины размс-чюм 76/ п,о, кодирующий N - концевую часть тими- динкиназы вируса осповакцины,
-Hind II - Rsa I фрагмент ДНК чируса осповакцины размером 80 п.о., кодирующий 7,5 к промотор,
-Hind II - BamT 1 линкерный фрагмент ( плазмиды pUC ртмером 6 п.о.
-ВятН I - Sal С I пик--ерный фрагмент ДНК размером 6 п,о.,
-Xho I - BamH I фрагмент fJiK вируса гепатита В размером 1273 п.о,, ко дирующий S-белок вируса гепатита В,
-BamH I - Cla I фрагмент ЛН« плэ миды pBR322 размером 35 п.о,,
-Cla I - EcoR 1 фрагмент Д(К вируса осповакцины размером п,о., i;o- держащий II к промотор/
-EcoR I - Fok 1 синтетический фрагмент ДНК размером 9 п.о.,
-Fok I - EcoR 1 фрагмент 1775 п.о., кодирующий структурные белки пируса клеи|евого энцсфплитл,
-EcoR 1 - Hind II фрагмент ЛИК ни- руса осповакцины размером 1071 и.о., кодируюи(ий С-концеву.1 часть IMHI /I H- киназы вируса оспооакцины/
-уникальные сайты рестрикции; Bamli I, Есо R I, Pst I, inr Ill, Xho I, SalG I;
-генетические маркеры r r-i3Mi; ;-i: amp - устойчивость к ампициллину.
2. Способ КОНСТруирОООН;- Г pO)Uf- ;Mнантной плазмидной Д|1К р7,5 ИСМь, заключающийся в том, что к ГЬо 
Изобретение относится к геиети- меской инженерии и биотехнологии, а именно к получению рекомбинантных антигенов вирусов клещевого энцефалита (КЭ) и гепатита В на основе вируса осповакцины (ВОВ). Рекомбинант- ная плазмидная ДНК p7,5S llCflE состо: ит из фрагмента генома вируса КЭ, фрагмента генома вируса гепатита В, промоторов ВОВ и плазмидного вектора, обеспечиваюсиего встройку указанных, компонентов в ТК-ген ВОВ. В Кгтместпп фрагмента генома вируса КЭ используют фрагмент ДНК длиной 1775 п.о. , кодирующий комплекс генов С, М, Е. В качестве фрагмента генома вируса гепатита В используют фрагмент вирусной ДНК, содержа1чий ген HBsAg. П качестве СИЛЬНОГО промотора для экспрессии генов ВКЭ используют 11к промотор 80В, а в качестве плазмидного вектора, обеспечивающего интеграцию ДНК вирусов КЭ и гепатита В в состав гена тимидинкиназы ВОВ, а также для экспрессии гена HBsAg под контролем 7 5к промотора ВОВ используется плазми- да pVAR 15. Рекомбинантные вирусы осповакцины, полученные на основе указанных компонентов, экспрессируют по- липептиды, которые вызывают образование у животных антител, связывающихся с основными белками оболочки вирусов гепатита В и клещевого энцефалита. Q « сл сл сл О5 CD О5
го энцефалита в титрах 1/160 и 1/1бО- 40 Ва чН I Фрагменту ДНК пирусй гг:;,гги 1/320, и у 1 кролика - индукция анти- та В, содержащему ген , npi-iii an- тел ПРОТИВ HBsAg вируса гепатита В ют Sal GI - БатН I линко,), гг.,- в титре 1/200.HBsAg в составе образовг-; -. г сел
Таким образом, в изобретении впер- ВапН I - ПптИ l фрагмснгй .::.-:у 0г вые осуществлена экспрессия генов ви- 45 ° русов клещевого энцефалита и гепати-сайту о f: (Topt; г под контролем 7,5 к ..ого; чего полученную рекомПни,,;,-,-,
.. ,
, М-Ч./.:; r;J .0
та В в составе одной рекомбинантной
ЛИК.
50
Формула изобретения
-Hind III - Pvu It фрагмент ДНК . вую рско/. оинантну :, n.i плазмиды рВК322 рг-зисром 2326 п.о., НС.; ..
неполного гидролиз. IJ тазой, а затем l ;cciR и к IJanill I - КсоК I Л плазмидь i7,5S npncn.. EcoR I фрагмент плозм дерм- и;ий структура :;
ВапН I - ПптИ l фрагмснгй .::.-:у 0г 45 °
50
55 КЛСГЧ- Р.ОГО эпи-.:; -- лем II к npof..oropri, и
-сайту о f: (Topt; г под контролем 7,5 к ..ого; чего полученную рекомПни,,;,-,-,
МИДУ ГИДРОЛМ.ЧУЮТ Г) уг;
неполного гидролиз. IJciir. 1 - тазой, а затем l ;cciR - :r,r; и к IJanill I - КсоК I ЛИ) : ;.::,;: плазмидь i7,5S npncn..,-;; i: ..- EcoR I фрагмент плозм - /; . ;.г дерм- и;ий структура :; с ,
.. ,
, М-Ч./.: r;J .0
| Poaletti Е | |||
| et П | |||
| Antiviral research, 1985, Suppl,1, 301-308 | |||
| Прибор для нагревания перетягиваемых бандажей подвижного состава | 1917 |
|
SU15A1 |
