Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для диагностики вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных, генной инженерии, биотехнологии, микробиологической промышленности, в частности выявления парвовируса свиней, а также в практической и экспериментальной ветеринарии для идентификации парвовируса свиней в пораженных плодах, отдельных органах и тканях.
Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности способа.
Для этого 25-35%-ную суспензию исследуемой ткани, приготовленную на физрастворе, после денатурирования нуклеиновых кислот разводят в нескольких пробах от 10 до 100 раз в ячейках 96-луноч- ной микроплаты для иммунологических исследований. В микрообьемы исследуемых
образцов вносят меченую денатурированную ДНК гибридизационного зонда M13/PPV. В эти же пробы вносят нитроцел- люлозные мембраны в форме кружков диаметром 4 мм, к которым заранее пришивают ДНК гибридизационного зонда pPV4. Гибридизацию осуществляют 16-24 ч. Далее мембраны отмывают в течение 0,5-1 ч в ячейках, в которых проводят гибридизацию. Подсчет радиоактивности мембран в сцин- тилляционном счетчике позволяет получить результат в количественном выражении. Учет результата возможен в наглядной форме методом авторадиографии.
Пример 1. А) Выделение и очистка репликативной формы (РФ) ДНК парвовируса свиней.
РФ ДНК выделяют из зараженной вирусом культуры клеток почек поросят (линия
О
о N
00 GJ
ППК), собирая клетки через 21 ч после заражения. Заражение проводят через 16 ч после пересева клеток т.е. при формировании 50%-ного монослоя. Клетки отмывают в буфере, содержащем 150 мМ NaCI, 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА, и ресуспен- дируют в этом буфере до плотности 2 х х 10 кл./мл. Суспензию клеток смешивают с равным объемом указанного буфера, содержащего 1,2% ДС-Na и мягко перемешивают до образования однородного лизата. Объем лизата в расчете на биомассу с 2,5 л культуральной среды составляет 40 мл. К лизату добавляют протеиназу К до концентрации 250 мкг/мл и инкубируют 2 ч при 37°С. Затем к лизату добавляют NaCI до концетрации 1 М, охлаждают во льду в течение 16 ч, центрифугируют при 12000 g в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а из надосадка собирают нуклеиновые кислоты путем путем добавления 2,5 объемов холодного этанола и центрифугирования при 10000 g в течение 15 мин. Нуклеиновые кислоты растворяют в буфере ТЕ, содержащем 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, и экстрагируют растЕюр равным объемом смеси фенол : хлороформ. К водной фазе добавляют ацетат натрия до концентрации 0,3 М, собирают нуклеиновые кислоты добавлением 2,5 объемов холодного этанола и центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Нуклеиновые кислоты растворяют в 0,5 мл буфера ТЕ, добавляют РНК-азу до конечной концентрации 100 мкг/мл, после чего инкубируют 1 ч при 37°С. Раствор экстрагируют последовательно равными объемами фенола, смеси фенол : хлороформ и хлороформа. Нуклеиновые кислоты собирают из водной фазы, как описано выше, и растворяют в буфере ТЕ. Данный препарат содержит ДНК репликативной формы парвоаируса свиней, часть хромосомной ДНК клеток-хозяев и малые количества РНК.
Очистку РФ ДНК вируса проводят методом препаративного электрофореза с применением агарозных гелей с низкой температурой плавления.
Б) Клонирование фрагмента РФ ДНК парвовируса свиней в плазмидном векторе pBR322.
ДНК плазмиды pBR 322 (2 мкг) гидроли- зуют эндонуклеазной Pst I в 20 мкл буфера состава: 50 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCIa, 1 мМ дитиотрейтол и 5 ед. фермента. Реакцию проводят в течение 1 ч при 37°С. Раствор экстрагируют равным объемом фенола и переосаждают ДНК этанолом. Затем ДНК гидролизуют рестрикта- зой EcoRI в тех же условиях за исключением концентрации NaCI (100 мМ) после чего повторяют фенольную экстракцию и переосаждение. Осадок ДНК растворяют в 20 мкл буфера ТЕ. Результат ферментативного расщепления проверяют при помощи злектрофореза в 0,8%-ном агарозном геле. При правильном расщеплении образуются фрагменты размерами 3,61 и 0,75 т.п.н.
ДНК репликативной формы парвовируса свиней обрабатывают рестриктазами Pst
0 и EcoRI, как зто описано выше для плаз- мидной ДНК.
Обработанные ДНК плазмиды и вируса объединяют по 0,5 мкг в буфере, содержащем 0,066 М трис-НС, рН 7,5, 5 мМ MgCIa,
5 5 мМ дитиотрейтол, 1 мМ АТФ, и к раствору добавляют 1 ед. ДНК-лигазы фага Т4, Реакцию лигирования проводят в течение 16ч при 15°С. Лигазную смесь используют для трансформации клеток E.coll.
0Компетентные клетки E.coli штамма С600 получают с использованем . Трансформацию проводят при 0°С в течение 40 мин, затем при42°С в течение 10 мин. После трансформации клетки E.coli инкубируют с
5 аэрацией в жидкой среде LB при 37°С, затем высевают на агаризованную среду, содержащую 15,0 мкг/мл тетрациклина. Выросшие колонии пересевают на среду, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, и от0 бирают чувствительные колонии.
ДНК из отобранных клонов выделяют и исследуют рестриктазным анализом с последующим электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле. Отбирают клоны, которые.
5 содержат плазмиды размером 6.8 т.п.н., а при гидролизе рестриктазами Pst I и EcoRI образуют фрагменты размерами 3,6 и 3,2 т.п.н. Эти клоны используют в качестве продуцентов ДНК при pPVI. Эффективность
0 штамма составляект 1 мгДНКгибридизаци- онного зонда на 1 л бактериальной культуры.
Пример 2. А) Выделение фрагмента генома парвовируса свиней из ДНК плазми5 ды pPVI и встраивание ее в ДНК плазмиды PUC19.
ДНК плазмиды pPVI обрабатывают рестриктазами Pvu II и Pst I в буфере, указанном в примере 1, Б, и в тех же условиях.
0
ДНК плазмиды pUC19 обрабатывают рестриктазами Pst l и Smal в буфере, содержащем 20 мМ KCI, 10 мМ трис-HCI. рН 8,0. 10 мМ MgCl2 и 1 мМ дитиотрейтола,
5 После фенольной экстракции и переосаждения этанолом ДНК обоих плазмид смешивают в равных количествах и добавляют 1 ед. ДНКлигазы фагаТ4 на 1 мкг ДНК. Цитирование проводят аналогично примеру I.
Проводят трансформацию клеток E.coli JM-103, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину и имеющие нарушенную активность (3 -галактозидазы, выделяют плазмидную ДНК из 12 клонов и проводят ее расщепление рестриктазами Pstl и EcoRI. Отбирают клоны, содержащие плаз- мидные ДНК, которые при данном анализе образуют фрагменты размерами 2,1 и 2,7 т.п.н. Данные клоны используют в качестве продуцентов ДНК pPV191.
Б) Выделение фрагмента ДНК парвови- руса свиней из ДНК плазмиды pPV191 и встраивание ее в ДНК плазмиды pBR 322.
ДНКплазмиды pPV191 и PBR322 обрабатывают рестриктазами Pst I и ECoRI, проводят фенольную экстракцию и переосаждение этанолом и лигирование, как описано в примере 1.
После трансформации клеток E.Coli C- 600 отбирают клоны, устойчивые к тетрациклину и чувствительные к ампициллину. Выделяют ДНК плазмид из 12 клонов и проводят ее расщепление рестриктазами Pst I и EcoRI. Отбирают колонии, содержащие плазмидные ДНК, которые дают фрагменты 2,1 и 3.6 т.п.н. Данные клоны используют в качестве продуцентов в ДНР pPV4.
Пример 3. Конструирование реком- бинантной фаговой ДНК M13/PPV.
ДНК плазмиды pPVI обрабатывают рестриктазами PVull и EcoRI, как указано выше.
ДНК репликативной формы фага М13 обрабатывают рестриктазами EcoPV и EcoRI в буфере, используемом при обработке ECoRI в примере 1, Б. Лигирование проводят, как описано выше.
ДНК лигазной смеси трансформируют E.coli штамма JM-103. Фаги высевают на газоне E.coli. Отбирают колонии с нарушенной активностью ft -галактозидазы. Из 12 колоний с рекомбинантным фенотипом выделяют фаговую ДНК репликативной формы. Ее исследуют, расщепляя рестриктазами EcoRI и Pstl. Отбирают колонии, которые содержат ДНК, образующую при данном анализе фрагмент размером 1 т.п.н., совпадающий по электрофоретиче- ской подвижности в 1 %-ном агарозном геле с нанесенной рядом ДНК фрагмента вирусного генома, ограниченного сайтами ре- стриктаз Pvull-E.coli. Данные колонии фага используют для заражения E.coli штамма JM-103 для наработки рекомбинантной ДНК гибридизационного зонда. Пример 4. Обработка образцов для исследований. 100 мкл 30%-ной суспензии внутренних органов абортированных плодов обрабатывают
проназой концентрации 500 мкг/мл в присутствии 0,20% ДС-Na при 37°С в течение 30 мин. Нуклеиновые кислоты денатурируют нагреванием до 100°С в течение 10 мин,
затем добавляют NaOH до концентрации 0,5 М и выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 1/2 обьема раствора, содержащего 0,5 М трис-HCI, 1 М NaCI, 0,3 М ацетата Na, 1 М
0 HCI и сразу используют для анализа,
В случае применения биотинового ме- чения после проназной обработки проводят однократную фенольную экстракцию и переосаждение этанолом.
5 Пример 5. Проведение непрямой гибридизации.
Нанесение материала на нитроцеллю- лозные мембраны и проведение гибридизации.
0Образцы тканей наносят на нитроцеллюлозные мембраны по 2-5 мкл в различных разведениях в растворе 4 х ССР (1 х х ССР: 0,15 М NaCI, 0,015 М цитрата натрия). Мембраны подсушивают и выдерживают в
5 течение 2 ч при 80°С.
Мембраны выдерживают в растворе для гибридизации, содержащем 4хССР, 0,25%ДС Na, 1-кратный раствор Денхардта (по 5 г/500 мл, фикол, БСА, поливинилпир0 ролидон), 200 мкг/мл ДНК тимуса теленка, в течение 2 ч при 65°С (предгибридизация). Затем проводят гибридизацию в тех же условиях в течение 16 часов в минимальном объеме указанного раствора с добавлением
5 меченой денатурированной ДНК гибридизационного зонда.
ДНК зонда метят при помощи встраивания дезоксинуклеозидтрифосфатов, меченых Р в d-положении, или биотипом, в
0 реакции никтрансляции. Денатурируют ДНК зонда, как описано в примере 4.
Мембраны отмывают в следующем режиме: в растворе 2хССР, 0,1% ДС-Na в течение 15 мин, при комнатной температуре;
5 дважды в том же растворе по 30 мин при 65°С; в растворе 0,1хССР при комнатной температуре в течение 15 мин.
Результаты реакции учитывают методом радиоавтографии на рентгеновской
0 пленке.
В случае использования биотиновой метки мембраны выдерживают в течение 30 мин в буфере АР, содержащем 0,1 М NaCI, 0,1 М трис-HCI, рН 9,5, 1 мМ MgCl2, куда
5 добавляют 3% БСА и 1% казеина. Затем мембраны подсушивают и выдерживают в течение 30 мин в минимальных объемах буфера АР с добавлением коньюгата стрепто- авидин-пероксидаза до концентрации 15 мкг/мл при комнатной температуре.
Отмывку проводят при комнатной температуре в следующем режиме: дважды в буфере АР в течение 10 мин; дважды в растворе 0,1хССР в течение 10 мин,
Окрашивание проводят в растворе, содержащем 10 мМ К-фосфатного буфера, рН 6,5, 0,05% Н202 и 0,01 % сртодианизиди- на, при комнатной температуре в течение 5-30 мин, в зависимости от степени окрашивания. Реакцию останавливают, промывая мембраны водой.
Пример 6. На кружки мембран диаметром 4 мм наносят по 0,1 мкг денатурированной ДНК плазмиды рРМ4 и иммобилизуют в течение 2 ч при 80°С.
В ячейки 96-луночной микроплаты вносят по 50 мкл образцов, приготовленных, как описано в примере 4, в различных разведениях в растворе для гибридизации (пример 5, А). Туда же вносят нитроцеллюлозные мембраны с иммобилизованной ДНК зонда pPV4, которые предварительно выдерживают в течение 2 ч при 65°С в растворе для гибридизации. После этого вносят ДНК гиб- ридизационного зонда М 13/PPV, меченую Р или Н и выдерживают при 65°С в течение 16ч.о
Мембраны отмывают в ячейках микроплаты в режиме, описанном в примере 5, Б.
Оценку результатов реакции проводят методом сцинтилляционного счета радиоактивности мембран после их высушивания.
Чувствительность метода прямой гибридизации с использованием зонда pPV4 составляет 0,2 нг ДНК на 1 мл.
Метод сендвич -гибридизации с использованием зондов pPV4 и М 13/PPV позволяет определить вирусную ДНК в концентрации 0,01 нг/мл, что соответствует концентрации вируса 0,03 нг/мл.
Таким образом, предлагаемый способ обладает по сравнению с известными высокой специфичностью, чувствительностью, технологичностью.
Формула изобретения
Способ выявления парвовируса свиней, включающий проведение ДНК-ДНК гибридизации анализируемого образца с ДНК- зондами, оценку результатов путем
подсчета радиоактивности, отличающий- с я тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности, способа в качестве анализируемого образца используют клинические образцы ткани, гибридизацию
проводят в непрямой сэндвич -форме, а в качестве зондов используют рекомбинант- ныеДНКрРУ4иМ 13/PPV,
2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPV4, используемая в качестве гибридизационногозонда для выявления парвоаируса свиней, размером 5,75 т.п.н., содержащая: -Pst l-EcoR l-фрагмент ДНК парвовируса свиней размером 2,15 т.п.н; -Pst l-EcoR I - фрагмент ДНК плазмиды рВК322 размером
3,6 т.п.н.; -уникальные сайты рестрикции: EcoR I, Pvu II и Pst t, расположенные на расстоянии 2..1; 3,6 т.п.н. соответственно, от сайта EcoR I: генетический маркер Тсг - ген устойчивости к тетрациклину.
3. Рекомбинантная фаговая ДНК М 13/PPV, используемая в качестве гибриди- зационного зонда для идентификации парвовируса свиней, размером 8,3 т.п.н., содержащая .-Pvu ll-EcoRt -фрагментДНК
парвовируса свиней размером 1 т.п.н.; - EcoRv-EcoR I - фрагмент ДНК фага М13 tg 130 размером 7,3 т.п.н.; - уникальные сайты рестрикции: EcoR I, а также Sph I, Kpn 1, BamH1, SaIG I, Pstl, расположенные в виде
полилинкера на расстоянии 1 т.п.н. от сайта EcoRL
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для выявления парвовируса свиней в пораженных плодах, отдельных органах и тканях. Цель изобретения состоит в повышении чувствительности и специфичности способа. Разработан способ выявления парвовируса свиней путем непрямой ДНК - ДНК гибридизации с использованием гибридизационных зондов. Сконструированы рекомбинантные ДНК на основе плазмиды PBR 322 и фага М 13, которые содержат фрагменты генома парвовируса свиней и служат гибридизационными зондами. 3 с.п.ф-лы.
| Доклады ВАСХНИЛ, 1988, № 11 | |||
| с | |||
| Многоступенчатый вращательный насос | 1924 |
|
SU2932A1 |
