Способ культивирования клеток костного мозга человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 

оо

ОС

4

iHH irir;.i к ГиЮ. ИМ ни и M(v

ч i - ку.чыifnnpofrinnio кле-((ПИЯ Hfi iHcrtH по.чучепие .iti)it))ui).))) кос той гк.чии.

///п, Л /7 / I 4);ir меиг1.1 к(н:т1)(И мо.иг и:ш.( к, 1()1 1 м{ ду.,7. 1ярпой ио. ЮС ги плоских костей .- южрчкой Фо. п-ксаил или .смиым ()4; и комсщлют в раствор Хеикга. (Чисто :.(),4ir)iu i( тк,чиь отделиют от кост- fibiA rpaficKv. н ();|,чре:1яют па кусочки ооьемом 3 Г) мм . lo. iyMeiiiu.ic фрагмен- Ti.i помсщакп но одному на ио.всрхность милл;|г10|п в1 1Х фильгрон (размер пор 0,4Г) мкм) площадью 64 мм. Ку, ьтини- юнамне пронодят па разделе двух фаз: )й vi:u и жидкой пшателыюй среды. Оргаипое положение достигается на Т01Ч, что каж.аый фи;|ьтр располагают над отверстием п пласгиковой платформе, когорая выполнена в фюрме толщиной 2 мм и наружным диаметром 50 мм с }|Ч ).ми (( 2 мм и несет 12 сквоз- Hbix f)TBCpcrnH, имекчцих (})0рму усеченного конуса. Каждый ми. л поровый фильтр но- меп1ак)т п./ьтгформу над (тверстнем так, чтоГи;. кул)Ту)альпан среда с.мачквала ниж- nioio нпверхь ск т), фильтра. Платформу с |)ил1л рами помен)ают в периферическую част1. чаппо Кошк я, куда :и1липается культу), льпая среда. Центральную часть .ча1пки, отгрроженмую стеклянным бортиком, : аполняют раствором Хенкса. Старилизацию платформ U (jiH. ibrpoH нроизподят у-облуче- нием п дозе 35000 Ог. Культу()альная среда состоит из 80% среды а-МЕМ, 20% сыворотки к))ви человека V группы, 0,05% -гл10тамина, OJ. i% витамин,) С. 0,4% глюкозы, а гакже а1ггн6потиков пенициллина и стрегггомицина (по iOO ед, на мл), рЫ среды 7,4. После заполнения газовой фазой (воздух с добавлением 5% СО;) чашку Кон- нея герметически закрывают стеклянной крышкой нри ПОМОН1И замазки, которую готовят из вазелина с добавлением 10% воска. Температура культивирования 37°С. Если . для культивирования используется (Х); -ипку()атор, чашки КомЕзея не 1 ермети- зируют. Смену культуральной среды на новую производят на 3/4 объема дважды в иеде..-|ю. При -ггом, начиная с 7--15-го дня культивирования, в состав питательной среды ВВ1)ЛЯ1 1,з-(}-1 липсрофгд-фат и гидрокортизон в конечных концентрациях еоответ- ствепно и 10 мМ. Фильтры вместе с эксплантатами фиксируют и подвергают гис- го. югичсской обработке, в результате которой получают срезы пли тотальные нрена раты.

К 20 му янк) к -//ьгивирования вокруг ксжчап I H.I шяи рхности ({шльтрор об- .чуетсь ()Г)1пи|1иая .многое.чойная зона рос- I, 4 - ii - f - -U /K. u { иОроб.частами

. 11)(1ЯСл ИСИ-п 1U

О1 .1: же1пи .межкле гочп(.)го основ- нг ак (jiiiopon.iacrbi. так и ме.к5

0

5

О 0

0

5

5

0

5

К, - очное И )|( Ч О Н|10ЯВ.(Я1О1 pCfKr) П(1ЛОЖ1 1с.тьиую pi -aKnHK.i на П1е. ((|)a- та iV, по НС содержат не зсгво)имых со- ..1СЙ кильпия. 1аким образом, при указанном режиме- культивирования дифференцированная костная ткань не формируется.

Пример 2. Костный мозг извлекают нa логичным , псх ле чег о из него приготовляют суспензию дезагрегированных клеток. Для этого костно-мозговую ткань в 5 мл раствора Хенкса многократно пропускают через 1лприц с иг, умень па- ющет ося диаметра, полученную взвесь фильтруют через 4-слойный капроновый фильтр и центрифугируют п течение 10 мин при 800 об/мин, клеточный осадок ресуспепзи- руют в среде сс-МЕМ и доводят концентрацию до IX О ядерных клеток на мл.

Все последующие этапы культивирования (рроводят, как описано в примере К за исключепием того, что на поверхность фильтров помеша ют не фрагменты костного мозга, а суспензию косшо-мозговых клеток в количестве ( -iO)X 0 клеток на каждый фильгр.

В таких культурах на поверхности фильтров образуются отдельные очаги и сливные .зоны хострш-мозговых фибробластов с примесью макрофагов. Толщина образующегося клеточного слоя, как и количество отложившегося основного вещества, значительно уступают тем, которые развиваются при эксплантации фрагментов костного мозга

Пример 3. Фрагменты костного мозга, и суспензии костио-мозговых клеток приготовляют методами, аналогичными тем, которые описаны в примерах 1 и 2. Однако 1еред эксплантацией клеточных суспензий на фильтры помешают желатиновые губки, применяемые в клинике в качестве кровоостанавливающего средства. Эти губки предварительно разрезают на пластинки толп.ип1ой 1 .мм и площадью около 20 мм . Суспензии клеток помещают на поверхность желатиновых губок, нанося с помощью микропинетки или стеклянного капилляра по ( )Х 10 клеток на каждую губку так, что клетки проникают внутрь, пропитывая всю толщу губки. Другое отличие состоит в концентрациях вводимых в куль- туральную среду Na-Э-глииерофосфата и гидрокортизона, составляющих соответственно 10 и 10- мМ.

f3 таких культурах, как при эксплантации фрагментов, так и клеточных суспензий, вокруг эксплантата развивается обширная, компактная, многослойная фибробластиче- ская зона роста и происходит интенсивное образование .межклеточного ос1ювиого вещества. К 20-дню культивирования на по- верхиости фильтров формируется грубо- волокнистая костная ткань, состоящая из костпых балок, покрытых остеобластами, с замурованными в основном веществе ос / еоцитами. }{а поверхности костных ба,лок

рзсгюлагаются н остеокласты. Как клетки, гяк и основное вещество кости проявляют положительную реакцию на щелочную фосфатазу; основное вещество содержит большое количество нерастворимых солей кальция, т.е. подвергается минералиляции. Л аксимального развития и наиболее полной дифференцировки костная ткань достигает на 4-ю неделю культивирования.

Пример 4. Получение, эксплантация и культивирование фрагментов и клеточных суспензий костного мозга человека осуществляют способом, аналогичным описанному в примере 3, за исключением того, что увеличены концентрации Na-p-глииеро- фосфата и гидрокортизона (соответственно 100 и мМ). Такие концентрации оказывают токсическое действие на культуры: не развивается многослойная зона роста и не происходит отложения основного вещества костной ткани.

0

ili.1 t: nni}C Clilifl Способ КуЛЪТИВИ:Н)ПаНИЯ К. Н ТОК K HTIIfirii

мозга человека, ик.чнтчающпи ч. I;(ICTH() мозговой ткани, получение из пег клеюч ной суспензии, культивирование ее ii;i ми.мли поровых фильтрах в стандартной сре.че с добавлением (.:ывор(1тки кроии че. группы, /-глютамиса. ( 1ли1ки ы и антибиотиков, с прследуюшой ммокжпат ной сменой среды, отчищающийся тем, что. с целью получения дифференцированной костной ткани, на мнллипоровые (|1ильтры устанавливают желатиновые губки, в качестве стандартной среды используют сроду а-МЕМ. при первой смене исгюльзуют среду того же состава, а при последующих сменах в среду дополни 1сльно вводя Na-fi- глицерофосфат в концентрации 5-20 мМ и гидрокортизон в концентрации (0.3-3)Х Х10 мМ.

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к культивированию клеток человека. Целью изобретения является получение дифференцированной костной ткани. Суспензию костно-мозговых клеток культивируют на миллипоровых фильтрах, снабженных желатиновыми губками, вначале в питательной среде а-МЕМ, содержащем 20% сыворотки крови человека, 1-глю- тамин, витамин С, глюкозу, антибиотики, а затем после смены на среде того же состава с добав-пением Na-p-глицерофосфата в концентрации 5 -20 мМ и гидрокортизона в концентрации (0,3-3)Х Ю мМ.