Способ получения рекомбинатной вакцины к гепатиту В Советский патент 1993 года по МПК A61K39/29 

(46) 30.06„93. Бголо № 24

(21)4119880/13I

(22)1.08.86,

(71)Институт иммунологии и Институт вирусологии АНИ СССР

(72)И.В. Красильников, Н.Н. Грановский, В.М. Жданов, Р.В. Петров,

Б.М. Гирдо и И.Ю. Коткона

-.

(56)Waurpber D . et al., RNAS, 1985, V 82, pp, 6830-683Д.

(54) СПОСОБ ПО.ПУЧЕПИЯ РЕКОМВИНАНТНОЙ ВАКЦИНЫ К ГЕПАТИТУ В

(57)Изобретение относится к биотехнологии, ,а именно, к получению реком- бинантных вакцин к гепатиту В путем микробиологическогл синтеза. Цель

изобретения - повьшение выхода и чистоты целевого продукта. Способ позво- ляет получать вакцинирующий препарат с выходом 60-67% с содержанием белков JO/S. Штамм дрожжей продуцент HBsAg культивируют на среде, не содержащей фосфат, разрушают клетки на дезинтеграторе, выделяют и очищают HBsAg путем адсорбционной хроматографии на пористых кремнеземах с элю- цией бикарбонатным буфером рН 9,1-9,5 с последующим ультрацентрифугированием в градиенте плотности 50%-ного раствора тартрата K(Na) и 25%-ного раствора глицерина при соотношении компонентов 1 I,

Изобретение отиоситсч к биотехнологии, в частности к получению реком- бинантных вакцин путем микробиэлоги- ческого синтеза, пыделеиия и обработ ки антигена для приготовления вакцин- препарата.

Цель изобретения - повышение выходя и чистоты целевого продукта.

Пример I. Получение биомас- сы дрожжевых клеток, содержащих НВьЛд. 2-3 крупные колонии дрожжевых ;;леток, штамм ДАН 12/р NMYG 20 (диаметром 3-5 мм), выросшие на среде

10

Пример 4. Адсорбционная хр матография. К полученному полуфабри кату (280 мл) добавляет макропорист стекло МПС-2000-ВГХ, предварительно замоченное в воде (объемом стекла 0 мп). Суспензию перемешивают на качалке в течение 2 ч при 4 С. Посл того как стекло осядет, в супбрната те определяют содержание HBsAg. В иадосэдке содержится 0,4 мкг/мп вне сенного антигена. Затем стекло пере носят в колонку- и промывшот 500 мп 0,05 М фосфатно-солевым буфером. За

(ск. приложение), содержащей 2% ага |е тем.проводят элюирование антигена.

ра. засевают р 200 нп жидкой среды I в колбу объемом 2 л. Культуру инкубируют на качалке при 300--350 об/мин при 30 С в te4eHHe i сут. Концентра- ия клеток в конце выращивания соста- 25 йлпйт 2-610 кл./мл. Весь объем купътуры с терильно переносят в 9-10л срйды , предварительно стерилизо- кипячением 0,5 ч в ферментере.

Инкубащ о -ведут в ферментере с ий- 25 тенсивной аэраплей при отношении воздуха к среде по объему не меньше 2: в течение 24-30 ч, при 30 С до концентрации 1,8-2,110 кл./мп. Кой- троль чистоты культуры пройодят мик- 30 роскопированием. Клетки собирают центрифугированием при 10 ОООд S 5-20 мин При 0 и замораживают до -20-40 с.

П р и м е р 2. Цолучение полуфаб-. риката вакцины. Клеточную массу кон- - центрации 1,8-2,1-10 кл./мл размора- , живают, ресуспендируют в 100 мп буфера А (0,01 М NaHjP04 ,0,5 laCl , рН 7,2-7,4) и подвергают разрушению на дезинтеграторе ФУГ-1 при 400450 об/мин при 4 С (согласно инструкции к ФУГтО в течение 10 мин.

Окончанием процесса дезинтеграции служит достижение разрушения клеток

40

используя 0,05 М бикарбонатный буфе рН 9,1, Скорость элюции составляет 0,2 мл. Антиген элюируется с фронто бикарбонатного буфера. Полученный концентрат содержит 97% исходной ан тигенной активности и менее 10% тотального содержания белка.-Удельная активность препарата 220 мкг/мл, об ем 24 мл.

Пример 5. Для адсорбционно хроматографии используют полуфабрикат, полученнь.гй в примере 3s объемо 250 МП. Элюирование проводят бикарб натным буфером рН 9,5. Получают кон центрат с удельной активностью 300 ккг/ьш объемом 22 мп.

Выход 80%,

Пример 6. Адсорбционную хр матографию проводят по примеру 5. Буфер для элюирования имеет рН 993 Получают концентрат с удельной акти ностью 260 мкг/мл и объемом 25 мп.

Выход HB.sAg составляет 80%,

Пример 7. Ультрацентрифуги оование в градиенте плотности.

, Ё пробирках объемом 35 мл готовя градиент плотности} используя в кач стве тяжелого раствора 50%-ный кагш

Пример 4. Адсорбционная хроматография. К полученному полуфабрикату (280 мл) добавляет макропористое стекло МПС-2000-ВГХ, предварительно замоченное в воде (объемом стекла 0 мп). Суспензию перемешивают на качалке в течение 2 ч при 4 С. После того как стекло осядет, в супбрнатан- те определяют содержание HBsAg. В иадосэдке содержится 0,4 мкг/мп внесенного антигена. Затем стекло переносят в колонку- и промывшот 500 мп 0,05 М фосфатно-солевым буфером. Затем.проводят элюирование антигена.

используя 0,05 М бикарбонатный буфер рН 9,1, Скорость элюции составляет 0,2 мл. Антиген элюируется с фронтом бикарбонатного буфера. Полученный концентрат содержит 97% исходной антигенной активности и менее 10% тотального содержания белка.-Удельная активность препарата 220 мкг/мл, объем 24 мл.

Пример 5. Для адсорбционной- хроматографии используют полуфабрикат, полученнь.гй в примере 3s объемом 250 МП. Элюирование проводят бикарбо- натным буфером рН 9,5. Получают концентрат с удельной активностью 300 ккг/ьш объемом 22 мп.

Выход 80%,

Пример 6. Адсорбционную хроматографию проводят по примеру 5. Буфер для элюирования имеет рН 993, Получают концентрат с удельной активностью 260 мкг/мл и объемом 25 мп.

Выход HB.sAg составляет 80%,

Пример 7. Ультрацентрифуги- оование в градиенте плотности.

, Ё пробирках объемом 35 мл готовят градиент плотности} используя в качестве тяжелого раствора 50%-ный кагше

90%, контролируемое при микроскопиро- .с во-натриевый тартрат на буфере А, В .вании. Дезинтеграт клеток центрифугируют при 0-20000хд и 4°С в течение 30-40 мин. Надосадочную жидкость собирают и замораживают при минус 20- ид 10 ч. Размороженный материал осветляют центрифугированием при 10-20000хд и в течение 40 мин. Титр HBsAg в приготовленном полуфабрикате составляет 20 мкг/мл среды.

50

качестве, легкого раствора используют 25%-ный раствор глицерина на буфере (суммарный объем градиента 20-25 мл) На градиент соЬтношения компонентов концентрат после адсорбциЬнной хрома тографии объемом I2 МП на одну пробирку. Ультрацентрифугирование прово дят 14-20 ч при 25 тыс. об./мин на SW 27-роторе при 4 С. После ультрацентрифугирования градиент фракциони руют, во фракциях определяют содержание HBsAg, объединяют фракции, содержащие более 10% антигена, нанесен ного на градиент. Получают 6 мл преПример 3. Полуфабрикат вак- цины готовят аналогично, но время замораживания 18 ч, получают полуфабрикат с титром 30 мкг/мл среды.

во-натриевый тартрат на буфере А, В

качестве, легкого раствора используют 25%-ный раствор глицерина на буфере А (суммарный объем градиента 20-25 мл). На градиент соЬтношения компонентов концентрат после адсорбциЬнной хроматографии объемом I2 МП на одну пробирку. Ультрацентрифугирование проводят 14-20 ч при 25 тыс. об./мин на SW 27-роторе при 4 С. После ультрацентрифугирования градиент фракционируют, во фракциях определяют содержание HBsAg, объединяют фракции, содержащие более 10% антигена, нанесенного на градиент. Получают 6 мл препарата с удельной активностью 760 мкг/мп.

Выход 85%.

Пример 8. Ультрацентрифуги- рование осуществляют по примеру 7, используют концентрат по примеру 5. Получают 8 мл препарата с удельной актй1&ностью 800 мкг/мп,

Выход 97,0%.

Пример 9. Используют концентрат по примеру 6. Ультрацентрифугирование проводят,как в примере 7. Получают 6 мл препарата с удельной активностью 780 мкг/мп.

Выход 70%.

Пример 10. Приготовление вакцинного препарата осуществляют следующим образом. Объединенную фракцию объемом 6 МП с удельной активно- стью 760 мкг/мп диализуют против буфера А, после диализа препарат труют через фильтр с диаметром 0,45 мкл, определяют в нем концентрацию антигена, получают 8 мп с удель- ной активностью 550 мкг/мп, разводят физраствором до концентрации 15мкг/мл Полученную суспензию перемешивают пе риодически в течение 2-18 ч и разливают в ампулы. Получают вакцинный препарат.

Выход антигена 60%.

Объем серии 280 мл. Содержание примесей, по данным электрофореза, в полиакрйламндном геле ,составляет около 10%.

Пример 11. Объединенную фракцию, полученную по примеру 9, диализуют и фильтруют через фильтр диаметром 0,45 мкм. Получают препара объемом 10 МП, содержащий 600 мкг/мп HB.sAg. В препарат добавляют стерильн гидроокись алюминия до конечиой концентрации 1 мг/мл и суспензию разводят стерильно физраствором до 400 мл Из полученного раствора отбирают аликвоты 1объемом 25 мп) на анализы, остальное разлнвают в ампулы. Вакцинная партия содержит 15 мкг/мп антиге иа, количество белковых примесей со- ставляет не более 10%.

Выход антигена составляет 67Z от исходного полученного полуфабриката.

Пример 12. Объединенную фракции, полученную по примеру 10, диапнэуют, фильтруют и разводят ана- логично примеру II. Получают вакцин- иую серию, объем которой составляет 300 МП.

Выход антиг вна 60% от исходного, полученного в полуфабрикате.

Содержание примесей в вакц1тн том препарате, по данным электрофореза, полиакрйламндном геле составляет не более 10%.

Вакцинный препарат (конечный продукт) имеет следующие характеристики им yнизиpyющaя доза 1 мп; рН препарата 7,6-7,8; количество белка в дозе не более 20 мкг/мп; количество HBsAg не менее 5 мкг/мл; содержание примесных белков - не более 10% от общего количества белка; содержание гидроокиси А - не более 1,2 мг/доза.

Препарат стерилен, неинфекционён, нетоксичен.

Препарат способен индуцировать синтез антител, специфических к HBsAg, у животных и человека.

Пример 13. Получение рекомбинант иой вакцины к гепатиту В из штамма-продцента дрожжей ДВУ 746 (pNMYG 20).

Приготовление биомассы, разрушение « очистку и получение .готового препарата проводят последовательно по примерам I, 2, 4, 7, 10,

Получают вакцинный препарат с выходом 58%. Объем серии вакцины 95мл, содержание антигена 12 мкг/мл, содержание примесей по данным электрофореза - не более 10%.

П р и м е р 1А. Получение реком- бинантчой вакцины к гепатиту В из штамма-продуцента дрожжей ДАН I2 (pHMYG 39-54).

Приготовление биомассы, разрушение, очистку и получение конечного продукта проводят по примерам 1, 3, 6, 9.

Выход рекомбинантного антигена составляет 67% от содержащегося в 1полуфабрикате.

Партия объемом 375 мп содержит 15 мкг/мп антигена, содержание примесей - не более 10%.

Пример 15. Данные по синтезу рекомбинантного HBsAg в штаммах- продуцентах дрожжей при культивировании в различных средах приведены в таблице.

1:4

1:256

Продолжение таблицы

Опыт Штамм-продуцент

Определение HBsAg в РПГА

среда I

I

среда It

3 1

1:2 1:8

2 ДАН 12/pHMYG 39/5А 1:4

1:8

Таким образом, синтез рекомбинант- него HBsAg намного выше при испольэо- каняи для культивирования ереды 2. 5Формула изобретения

Способ получения рекомбинантной вакцииы к гепатиту В, включающий культивирование штамма дрожжей про- . дуцента HBsAg иа питательной среде, 2 ДВУ 7A6/PHMYG 20 1:2 Г:128 разрушение клеток, выделение и очистку антигеиа, отличающий- 1:128 с я тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, 1:1024 культивирование проводят иа бесфосf5 фатиой среде, а выделение и очистку 1:2048 проводят, используя адсорбционную

хроматографию на пористых кремнезе- 1:2048 мах, с элюцией бйкарбонатны Г буфером рН 9,1...9,5 и последующее ультраВремя культивирования - 24 ч, центрифугирование в градиенте плотно- Антигеи определяли в экстрактах апи- сти 50%-ного раствора тартрата К(Ма) квот клеток дрожжей при одииаковых и 25%-иого раствора глицерина при условиях разрушергия и экстракции. . соотношении компонентов 1:1.

( ... . .

,Приложение

Состав сред культивирования дрожжей и микробиологического синтеза HBsAg (на 1л.)

Компоненты (в г) . КС1 КН.РО, Nad Глюкоза MgSO CaClj Аспарагин

Витамины (в мкг) Тиамин Рибофлавин Пиридоксин Никотииова кислота Пара-аминобензойная кислота 190-210

Пантотенат кальция

Ипозитол

1389060

1,9-2,1,9-2,1

(в мкг)

99-10199-101

9,9-10,19,9-10,0

9,9-10,19,9-10,1

9,9-10,19,9-10,

«9-5149-5