1-ЭТИЛ-6-НИТРО-7-(4-МЕТИЛПИПЕРАЗИНИЛ)-4-ОКСО-1,4-ДИГИДРОХИНОЛИН-3-КАРБОНОВАЯ КИСЛОТА ИЛИ ЕЕ ГИДРОХЛОРИД, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Советский патент 1995 года по МПК C07D401/04 A61K31/47 

Изобретение относится к химии производных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты и касается новых биологических активных соединений этого ряда, а именно 1-этил-6-нитро-7-(4-метилпеперазинил)-4-оксо- 1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты или ее гидрохлорида общей формулы
nHCl где n 0 (1а) или n 1 (1б), обладающих антибактериальной активностью.

Целью изобретения являются новые производные ряда 6-нитро-7-пиперазинил-4-оксохинолины-3-карбоновой кислоты, обладающие улучшенными антибак- териальными свойствами по сравнению с ближайшими структурными аналогами.

П р и м е р 1. Получение 1-этил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидро- хинолин-3-карбоновой кислоты (1а).

А. Получение исходного соединения 1-этил-6-нитро-7-хлор-4-оксо- 1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты.

К 32,45 г (0,1 моль) этилового эфира 1-этил-6-нитро-7-хлор-4- оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты приливают 100 мл концентрированной соляной кислоты и 10 мл уксусной кислоты и кипятят в течение 1 ч.

Смесь охлаждают, осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой, высушивают, очищают кристаллизацией из ДМФА.

Получают 25,2 г (85% ) 1-этил-6-нитро-7-хлор-4-оксо-1,4- дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты, т.пл. 292-294^оС (с разложением).

Найдено, C 48,22; H 3,04; N 9,40; Cl 11,86.

C₁₂H₉ClN₂O₅
Вычислено, C 48,57; H 3,04; N 9,44; Cl 11,97.

ИК-спектр, см^-1: 1720 (COOH), 1615 (C-O), 1510 (NO₂).

Масс-спектр, m/e: М⁺ 296.

Б. Получение целевого продукта 1а.

К 12,6 г (0,05 моль) 1-этил-6-нитро-7-хлор-4-оксо-1,4- дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты в 100 мл ДМФА прибавляют 25,0 г (0,25 моль) N-метилпиперазина и кипятят (130-140^оС) в течение 1 ч. Смесь охлаждают, растворитель упаривают в вакууме, к остатку прибавляют 50 мл воды, доводят рН раствор до нейтральной реакции (по лакмусовой бумажке), экстрагируют хлористым метиленом (3х50 мл), который затем сушат сульфатом магния и отгоняют под вакуумом досуха. Остаток очищают кристаллизацией из ДМФА.

Получают 12,96 г (72%) 1-этил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)- 4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты в виде кристаллического порошка красно-оранжевого цвета, т.пл. 242-243^оС.

Найдено, C 56,56; H 5,60; N 15,80.

C₁₂H₂₀N₄O₅
Вычислено, C 56,67; H 5,56; N 15,56.

ИК-спектр, см^-1: 1722 (COOH), 1620 (C-O), 1510 (NO₂).

Масс-спектр, m/e: М⁺ 360.

П р и м е р 2. Получение гидрохлорида 1-этил-6-нитро-7-(4-метилпиперзинил)-4-ок- со-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (1б).

К 3,6 г (0,01 моль) 1-этил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидрохино-лин-3-карбоново й кислоты прибавляют спиртовой раствор соляной кислоты до рН 1 при комнатной температуре. Смесь перемешивают в течение 1 ч, осадок отфильтровывают, промывают на фильтре спиртом, очищают кристаллизацией из ДМФА.

Получают 3,80 г (96%) гидрохлорида 1-этил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил-4-осо-1,4-дигидрохинолин- 3-карбоновой кислоты в виде темно-желтого кристаллического порошка, т.пл. 261-262^оС.

Найдено, C 51,48; H 5,0; N 10,62.

C₁₇H₂₀N₄O₅ ˙ HCl
Вычислено, C 51,45; H 5,04; N 10,59.

ИК-спектр, см^-1: 1735 (COOH), 1620 (C-O), 1510 (NO₂).

Изучение антибактериальной активности проводили в опытах ин витро в отношении грамотрицательных и грам- положительных бактерий возбудителей острых бактериальных инфекций и в отношении патогенных грибов, возбудителей микроспории, трихофитии, кандидоза (см. табл.1, 2, и 3). На чертеже приведен график влияния соединения 1а и оксалиниевой кислоты на репликацию клеток E. coli К-12. Ин витро оценивали влиянием соединений 1а и 1б на уровень синтеза ДНК клетками E. coli (см. чертеж), что является показателем механизма действия препарата.

В опытах ин виво на интактных белых мышах оценивали переносимость соединений 1а и 1б при введении внутрижелудочно или под кожу.

В опытах ин виво на инфицированных белых мышах изучали химиотерапевтическую активность соединений при инфекциях, вызванных E.typhi, E.coli, Pr. vulgaris.

Актимикробную активность соединений в параллельных опытах ин витро и ин виво (за исключением опытов ин виво с Pr.vulgaris) сравнивали с активностью известного аналога 1-этил-6-нитро-7-пиперазинил-4-оксо-хинолин-3-карбоновой кислоты (2), для которой описана только активность ин витро в отношении трех видов микроорганизмов E.coli. Ps.aeruginosa, E.аureus.

При изучении влияния 1а и 1б на биосинтез ДНК клетки E.coli в качестве препарата сравнения использована оксолиниевая кислота (1-этил-6,7-метилендиокси-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота), являющаяся также, как и новые соединения, производным хинолонкарбоновой кислоты. Оксолиниевая кислота широко применяется в медицинской практике и является активным ингибитором синтеза ДНК бактериальных клеток. Этим свойством оксолиниевой кислоты в первую очередь определяется ее активность ин витро. Кроме того, оксолиниевую кислоту использовали в качестве препарата сравнения в опытах ин витро с Ps.aeruginosa, учитывая важную роль этого возбудителя в этиологии тяжелых гнойных процессов.

Результаты изучения активности соединений 1а и 1б в опытах ин витро приведены в табл.1, 2 и 3 и на чертеже.

Активность ин витро изучена в трех сериях опытов в отношении 12 видов патогенных и условно-патогенных бактерий и в отношении трех видов патогенных грибов. Таким образом, антимикробные свойства 1а оценены в отношении 70 штаммов микроорганизмов, 1б в отношении 14 штаммов.

В первой серии опытов противомикробные свойства новых соединений в сравнении с аналогом 2 изучены на жидких питательных средах методом двухкратных серийных разведений с предварительным растворением веществ в диметилформамиде.

В опытах с бактериями использовали бульон Хоттингера (120 мг. аминного азота), в опытах с грибами бульон Сабуро (с добавлением 2% глюкозы и 2% мальтозы).

Активность изучена в отношении шести референс-штаммов бактерий (см. табл. 1) и трех клинических штаммов грибов M.canis 3/84, Tr.mentagsophytes (var.gypseum) 6/85 и C.albicans 1655, полученных из Центрального кожно-венерологического института.

Инокулят для бактерий 1 ˙10⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ) для грибов 1,5x x10⁶ КОЕ. Величину минимальной подавляющей концентрации (МПК) оценивали в опытах с бактериями через 18-20 ч после культивирования при 35-37^оС, в опытах с C.albicans через 24 ч и в опытах с дерматофитами через 5-6 сут после культивирования при 25-28^оС. Результаты опытов приведены в табл.1.

Как видно из табл.1, новые соединения проявляют высокую антибактериальную активность в отношении E.coli. Pr.vulgaris. E.aureus и Bac.subtilis, активны в отношении Ps.aeruginosa и Str.pyogenes, в опытах с E.coli, Pr.vulgaris, S.aureus, Bac.subtilis значительно более активны, чем соединения 2.

Соединения 1а и 1б, как и известное соединение 2, оказались в проведенных опытах не активны в отношении возбудителя микроспории, трихофитии, кандидоза (МПК 500 мкг/мл).

Оценка активности 1а в отношении M.tuberculosis на среде Сотона показала его значительно большую активность по сравнению с соединением 2 (МПК 23 и 1000 мкг/мл соответственно).

Во второй серии опытов (см. табл.2) оценивали активность соединений 1а 1б в отношении 7 видов бактерий в опытах с высоковирулентными штаммами, используемым для воспроизведения экспериментальных генерализованных инфекций. Опыты проведены на жидкой питательной среде при величине инокулята, в 10 раз большей (1 ˙10⁶ КОЕ мл), чем в первой серии экспериментов. В числе штаммов три клинических полирезистентных штамма стафилококка, устойчивых к метициллину к оксациллину. Результаты приведены в табл.2.

Как видно из табл.2, новые соединения высокоактивны в отношении штаммов S. typhi, E.coli. Shigella. S.aureus и превышают по активности соединение 2. В опытах с Ps.aeruginosa 165 и Pr.vulgaris не отмечено различия по активности при сопоставлении со структурным аналогом.

В третьей серии опытов оценка активности соединения 1а в сравнении с соединением 2 проведена на твердой агаризованной среде. В данном случае условия эксперимента максимально приближены к условиям, в которых изучалась активность соединения 2 в отношении трех видов бактерий. В данной серии опытов использован агар АГВ и метод двухкратных серийных разведений. Посев бактерий производили с применением штамма-репликатора по Sturs. Для приготовления инокулята использовали взвесь суточных бульонных культур бактерий с концентрацией микробных клеток в пятне, соответствующей 10⁴ КОЕ/мл. В этих экспериментах проведены расширенные опыты с 50 клиническими и эталонными штаммами бактерий. Посевы инкубировали при 35-37^оС 18-20 ч. Полученные результаты приведены в табл.3.

Как видно из табл.3, активность нового соединения 1а в отношении стафилококков, штаммов кишечной палочки, клебсиелл, иерсиний, спорообразующих грамположительных аэробных палочек (Bac.subtilis, Bac.cereus) существенно превышала активность соединения 2. В опытах с синегнойной палочкой для большинства штаммов различия в активности соединений 1а и 2 были несущественными.

Анализируя опубликованные данные для известного соединения 2 сравнительно с полученными данными, необходимо указать, что для отдельных штаммов E. coli, E.aureus и Ps.aeruginosa получены совпадающие значения (МПК 0,78-1, 12,5-15,6 и 25-31,2 мкг/мл соответственно). Незначи- тельные колебания находятся в пределах возможной ошибки опыта или особенностей методики с учетом свойств штаммов и величины изученных концентраций.

Изучение влияния соединений 1а и 1б на биосинтез ДНК в клетках.

Исходя из высокой антибактериальной активности соединений 1а и 1б ин витро, изучали влияние соединений 1а и 1б на биосинтез ДНК в клетках бактерий на модели репликации ДНК клеток E.coli. В литературе не описано влияние 6-нитропроизводных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты на синтез ДНК бактериальных клеток. Препаратом сравнения были оксолиниевая кислота, широко применяющаяся в медицинской практике, производное хинолонкарбоновой кислоты, высокоактивный ингибитор синтеза ДНК бактерий (специфический ингибитор ДНК-гиразы).

Опыты проведены в культурой E.coli К-12, находившейся в фазе логарифмического роста.

Влияние 1а и 1б на биосинтез ДНК оценивали по включению ⁹Н-тимидина в кислотонерастворимую фракцию клеток E.coli. Культуру E.coli К-12 на синтетической среде (5˙ 10⁸ клеток/мл), меченную ³Н-тимидином (конечная концентрация 20 мкл/мл), инкубировали с соединениями 1а и 1б или с оксолиниевой кислотой в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл в течение 30 мин при 37^оС при встряхивании. После окончания инкубации отбирали пробы по 1 мл, к которым добавляли аликвотное количество 10%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). После фильтрации на миллипоровых фильтрах (N 4) пробы высушивали и помещали во флаконы с толуольным сцинтиллятором и измеряли радиоактивность в счетчике Delta (Tracon, США).

Уровень ингибирования биосинтеза ДНК определяли по снижению включения ³Н-тимидина в кислотонерастворимую фракцию клеток E.coli.

Проведенные исследования впервые показали ингибирующее действие 6-нитропроизводных хинолонкарбоновой кислоты на биосинтез ДНК (см. чертеж). Как видно из чеpтежа, подавление включения тимидина при действии соединения 1а проявлялось в концентрациях 01,-10 мкг/мл. В проведенных условиях опыта ингибирующее действие соединения 1а в отношении биосинтеза ДНК во всех изученных концентрациях значительно превышало действие оксолиниевой кислоты специфического ингибитора ДНК-гиразы.

Активность соединения 1б по степени ингибирования синтеза ДНК была в параллельных опытах сравнима с активностью соединения 1а.

При сравнительном изучении активности ин витро соединений 1а и 1б и оксолиниевой кислоты показано, что изученные 6-нитропроизводные 4-хинолон-3-карбоновой кислоты в 16-32 раза более активны ин витро, чем оксолиниевая кислота в отношении Ps.arcruginosa. Опыты проведены с двумя штаммами Ps.acruginosa, МПК для соединений 1а и 1б составляют 15,6-31,2 мкг/мл, для оксолиниевой кислоты 500 мг/мл. Эти данные показывают важное значение нитрогруппы в положение 6 цикла для повышения антибактериальной активности.

Результаты изучения активности соединений 1а и 1б в опытах ин виво на моделях острых бактериальных инфекций белых мышей приведены в табл.4, 5 и 6.

Опыты проведены на 700 беспородных белых мышах массой 15-16 г по принятой методике на моделях с внутрибрюшинным заражением животных. Изучена активность соединений 1а и 1б сравнительно с аналогом 2 в опытах с инфекциями, вызванными брюшно-тифозной палочкой (штамм S.typhi 4446, заражающая доза 1х10⁷ микробных клеток), кишечной палочкой (штамм E.coli М-17, заражающая доза 5х10⁸ микробных клеток).

Кроме того, изучена активность соединения 1а в опытах с протеем (штамм Pr.vulgaris N 1, инфицирующая доза 1,5х10⁸ микробных клеток).

Использованные в опытах инфицирующие дозы вызывали гибель 80-100% контрольных нелеченных животных. Активность соединений изучали в диапазоне до 50-600 мкг/мл при введении однократно через 30 мин после заражения per os (для нерастворимых соединений 1а и 2), внутрь и под кожу (для растворимого соединения 1б). Длительность наблюдения за животными 10 сут. Результаты приведены в табл.4, 5 и 6.

Как видно из табл.4, соединения 1а и 1б проявляют высокий химиотерапевтический эффект при экспериментальной инфекции мышей, вызванной S.typhi, в том числе соединение 1б при введении под кожу. В аналогичных условиях опыта известный аналог 2 не активен.

Как видно из табл.5, новые соединения высокоактивны при экспериментальной смертельной инфекции мышей, вызванной E.coli, в том числе соединение 1б активно при введении под кожу. В этих же условиях опыта известный аналог 2 практически не активен.

Как видно из табл.6, соединение 1а активно при введении внутрь на модели смертельной инфекции мышей, вызванной Proteus vulgaris.

Как видно из табл.7, соединения 1а и 1б малотоксичны и хорошо переносятся белыми мышами (беспородными интактными) в дозах до 2000 мг/кг при введении внутрижелудочно и под кожу (1а) и в дозах до 1000 мг/кг при введении под кожу (1б). LD₅₀ для соединения 1а 2000 мг/кг при том и другом пути введения, для 1б 1000 мг/кг при введении под кожу.

В опытах на инфицированных животных оба соединения хорошо переносятся в дозах до 400 мг/кг внутрь (1а) и под кожу (1б). В более высоких дозах переносимость на инфицированных животных не изучали, так как дозы 400 мг/кг для того и другого соединения оказывали в химиотерапевтических опытах высокий лечебный эффект.

Таким образом, проведенные исследования показывают превосходство новых соединений (1а и 1б) по сравнению со структурным аналогом (2). Структурное отличие (сочетание нитрогруппы в положении 6 цикла и метилпиперазинилового остатка в положении 7) способствовало усилению активности ин витро в отношении сальмонелл, эшерихий, иерсиний, стафилококков, кроме того, отмечено расширение спектра за счет появления активности в отношении микробактерий туберкулеза (структурный аналог не активен).

Наиболее важным преимуществом новых соединений 1а и 1б является проявление активности в условиях инфи- цированного организма на моделях бактериальных инфекций при введении внутрижелудочно (1а) и под кожу (1б). Структурный аналог (2) в аналогичных опытах ин виво не активен (см. табл.4 и 5).

Новые соединения характеризуются низкой токсичностью: переносимые дозы для соединения 1а при однократном введении внутрь или под кожу до 2000 мг/кг, для соединения 1б до 1000 мг/кг при введении под кожу.

Кроме того, впервые на примере соединений 1а и 1б установлена высокая степень ингибирования синтеза ДНК бактериальных клеток (E.coli) под влиянием 6-нитропроизводных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты и значительное преимущество в степени ингибирования по сравнению с описанным в литературе производным хинолинкарбоновой кислоты активным ингибитором синтеза ДНК оксолиниевой кислотой (1-этил-1,4-дигидро-6,7-метилендиокси-4-оксохинолин-3-карбоновая кислота), широко применяющимся в медицинской практике лекарственным препаратом.

Изобретение касается замещенных дигидрохинолина (ЗГХ), в частности 1-этил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты и ее гидрохлорида, обладающих антибактериальной активностью. Цель - создание новых более активных веществ указанного класса. Синтез ведут кипячением этилового эфира 1-этил-6-нитро-7-хлор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты в среде HCl в присутствии CH₃COOH с последующим выделением соответствующей кислоты и обработкой N-метилпиперазином при кипячении в среде диметилформамида. Выход 72% , т. пл. 242 - 243°С, брутто-ф-ла C₁₇H₂₀N₄O₅. Полученный продукт переводят в гидрохлорид обработкой спиртовым раствором HCl. Выход 96%, т.пл. 261 - 262°С, брутто-ф-ла C₁₇H₂₀N₄O₅·HCl.. Антибактериальная активность ЗГХ проявляется против грамположительных и грамотрицательных бактерий, патогенных грибов, возбудителей микроспории, трихофитин, кандидоза при максимально переносимой дозе 0,5 - 1,25 мкг/мл, токсичность LD₅₀ 2000 мг/кг (для С₁₇H₂₀N₄O₅) и 1000 мг/кг (для C₁₇H₂N₄O₈·HCl ). 1 ил., 7 табл.

1. 1-Этил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота или ее гидрохлорид общей формулы

где n 0 или 1,
обладающие антибактериальной активностью.