Способ получения антибиотика @ -19393 @ и/или @ -19393 @ Советский патент 1984 года по МПК C12P1/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового антибиотика. Целью изобретения является полу чение нового антибиотика общей формулы х-Я -у KHCOCHj, где - антибиотик С-19393 S и/или R-Н - антибиотик С-19393 Н Цель достигается тем, что согла но способу получения антибиотика общей формулы V н Шз-у. -сС /г-0 о - NHCOCHj сош - антибиотик С-19393 S где ,R-SO,H и/или R-И - антибиотик С-19393 Н который заключается в том, что штамм Streptomyces С-19393 (IFo 13,886) культивируют в питательной среде, содержащей источники углеро да и азота, и выделяют целевой продукт из жидкой культуральной ср ды в виде смеси и/или отдельных ан тибиотиков. Для получения антибиотика С-19393 S и/или Hj изобретения ис пользуются микроорганизмы, произво дящие антибиотик С-19393 S.j и/или Hj., принадлежсодие к разновидности Streptomyces sp. Типичным примером такого микроорганизма является штамм Streptomyces sp С-19393, который получают посевом суспензии образцов почвы, собранной в Швеции, в стерильной воде на культурную среду, состоящую из 1% растворимого крахмала, 0,05% мочевины, 0,05% полипептона (Daigo Nutritive Chem.Ltd) 0,05% дрожжевого экстракта (Dif со uSA), 0,02% фосфата калия, 0,02% хлористого калия, 0,01% сульфата магния, 5 мг/мл блеомицина и 2% агара, имеющего рН 7,0 и повторяющейся очисткой микроорганизма из колонии, полученной в ходе культивирования при в течении 2 недельi Штамм С-19393 разновидности Streptomyces имеет следующие микробиологические характеристики. Морфологические характеристики. Воздушный мицелий, имеющий ширину около 1, вытягивается от хо рошо разветвленного вегетативного мицелия и моноподиально ответвляется от главной оси с образованием боковых цепей. Прямые или слегка изогнутые споровые цепи, наблюдаются на конце боковой цепи. Каждая спора имеет цилиндрическую форму (0,35-0,55-0,7-1,4) и имеет гладкую поверхность. Никаких специальных органов, таких как сферические спорангии, склероции, а также подвижны2| спор не наблюдается. Культуральные характеристики. Культуральные характеристики штамма в различных средах представлены в табл.1. Представленные характеристики наблюдали после культивирования при 28°С в течение 2 недель.. Таблица 1

Способ получения антибиотика общей формулы СНз щ . Н ИНСОСНз соон где -R-SOjH - антибиотик С-19393 Sj и/или R-Н - антибиотик С-19393 З ЛЮЧаЮЩИЙСЯ в том, что ШТс1ММ Streptomyces С-19393 (iFo 13,886) культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, и выделяют целевой продукт С/) КЗ жидкой фракции культуральной рреды в виде смеси и/или отдельных антибиотиков. Приоритет по признакам: 02.02.79 при получении антибиотика C-19393S2; 06.06.79 при получении антибиотика С-19393Н2. «vl ел со СХ)

Сахароза нитратный

агар , Умеренный

Глюкоза аспараНезначитель- -. гиновый агар ный

Глицерин, аспара гиновый агар

Умеренный

Крахмальный агар

Бесцветная Нет

Белый

-

I I

I

Охра

Питательный агар

Тиризиновый

агар

I I

Дрожжевой экстракт Экстракт мальтозы агар

Овсяно-мучной

« I j агар

Штамм С-19393 обильно растет на среде, содержащей 2% овсяной муки, 2% томатной пасты, 0,2% BovriE и 2% агара, имеющей рН 7,0 и происходит обильное образование серовато-желтого воздушного мицелия. Растворимого пигмента не образует.

Физиологические характеристики.

Температурный интервал роста: нижний предел ниже верхний предел 32-35 С; оптимальная температура 26,5-30®С.

Желатин разжижает, крахмал гидролизует, пептонизирует снятое молоко, но не коагулирует. Меланоидных пигментов тирозин-агар, и пептон-дрожжевой экстракт-железо-агар не образует.

Хорошо усваивает следующие источники углерода - глицерин, D-кслозу, L-арабинозу, D-глюкозу, D-галактозу, D-фруктозу, мальтозу, рамнозу крахмал. Слабо усваивает инозит, целлюлозу. Не усваивает D-маннит, схарозу, рафинозу.

Штамм Streptorayces С-19393 депонирован в Fermentation Reseach last Agencyof Ind.Science and TechnoCogy PERM-P № 4774 в институте ферментации. Осака под номером iFo 13886 и в American Туре Cuture СоКСection под номером AMCC 31486.

Шта1у1м Streptomyces С- 19393 (iFo 13886) культивируют в питательной среде, содержащей источники уг7 лерода и азота, в качестве источников углерода могут быть использованы глюкоза, крахмсЦ, глицерин декастрин, сахароза, студень из проса, маласса. Примером источника азота могут быть мясной экстракт, высушенные дрожжи, дрожжевой экстракт, соевая мука, кукурузный экстракт, пшеничные почки, хлопковый цвет, сульфат аммония, нитрат аммония. При необходимости мо гут быть использованы неорганичесПродолжение табл, 1

Слоновая

Белый кость

- Бесцветная

Серовато- -

1 желтый

Бесцветный

Белый

0

кие соли такие как карбонат кальция, хлористый натрий, хлористый калий, соль фосфорной кислоты, а также органические и неорганические вещества,которые способствуют

5 росту микроорганизма и могут добавляться в питательную среду в соответствующих количествах.

Кроме того, в среду могут Добавлять соли тяжелых металлов, как

0 сульфат железа, сульфат меди, а также витамины В, биотин. .

В среду могут добавлять противопенные и поверхностно-активные агенты, такие как силеконовые мас5ла, эфир полиалкиленгликоля.

Культивирование осуществляют в твердой или жидкой среде в услоьиях аэрации. Культивирование ведут при 15-32 с, рН 4-8 в течение 8-168 ч, предпочтительно 24-144 ч.

0

Антибиотик С-19393 S и Н производят внешнеклеточно и в ферментационном бульоне, отделяют полученную культуру от микробиальных клеток и верхний слой жидкости центри5фугированием или фильтрацией, а затем отделяют антибиотик от верхнего слоя жидкости. Однако антибиотик может быть также получен непосредственно из ферментацион-;-,

0 ного бульона.

Выделение С-19393 82 и Hj может производиться по методике обычно используемой, для выделения.метаболитов, производимых микроорганизмами. Так, например, поскольку С-19393 S2 и Н2 представляет собой водно растворимое кислотное соединение, вырабатываемое, главным образом, внешнеклеточно, методика, включающая удаление микробиальных клеток фильтрацией или центрифугированием и отделение, очистку и сбор активного вещества из фильтрата обычно используется для выделения С-19393 S и Н. Таким образом, раз5личные средства, использующие различие в растворимости и степени растворимости в различных раствори телях, различие в природе осаждения и скорости осаждения и различи в. адсорбционной: способности, а та же ионо-обменная хроматография, . хроматография на молекулярных сита концентрация при пониженном давлении и сушка замораживанием и т.п. могут использоваться сами по себе или в подходящей комбинации в любо порядке и с любым числом повторени Примерами подходящих адсорбентов могут служить активированный уголь адсорбционные смеси, анионо-обменн смолы (анионного типа), порошкообразная целлюлоза, силикагель и т.п. или носители, обладающие свой ствами мoлeкyJIЯpныx сит. Примерами элюирующих растворителей, которые могут использоваться, могут служит водные растворы водно-растворимых растворителей, таких как ацетон, метанол, этанол, пропанол, бутанол, изопропанол, изобутанол и т.п или водные растворы кислот или щелочей, или буфферные или водные растворы неорганических или органи ческих солей, хотя используемые растворители могут изменяться в зависимости от типа носителя. Ферментационный бульон, получен ный после завершения культивации,, фильтруют с использованием фильтрую щего средства с целью удаления мик робиальных .клеток. Полученный в ре зультате фильтрат пропускают через колонку с активированным углем в нейтральных или слабо-кислых условиях и адсорбированный антибиотик С-19393 S элюируют водой или гидрофильной растворительной системой Большая часть антибактериальной активности обнаружена в водном элюате. Поскольку антибиотик С-19393 Sявляется по природе кислым, такие анионо-обменные смолы типа С или АсО, как Амбердит 1РА-400, 402 и 410 могут применяться для дальнейшей очистки. Из полученного в результате элюата антибиотического соединения, активное вещество дополнительно элюируют водным раствором хлористого натрия или буфферным раствором. Обессоливание элюата достигается слабым подкислением элюата и хроматографической обработкой элюата активированным углем с последующим элюированием водным раствором спирта и т.п. Элюат, со держащий активное соединение, концентрируют при пониженном давлении при низкой температуре и к концентр ту добавляют этанол или метанол. Полученный осадок удаляют фильтрацией и полученный в результате водно-спиртовой раствор вновь концентрируют при пониженном давлении. К концентрированному осадку добавляют ацетон или аналогичное соединение и осадок отделяют фильтрацией. Полученный в результате порошок может быть подвергнут дополнительной хроматографической обработке с использованием колонной хроматографии с комбинацией фаз DEAE или QAE Сефадекс в СС -форме и адсорбента - смолы XAD или высоко пористой смолы типа Диаион НР-20. Водный раствор порошка, полученный выше, адсорбируют на DEAE Сефадексе А-25 (вСР - форме) и после промывания водой колонку элюируют 0,4 М водным раствором хлористого натрия. рН элюата устанавливают равным 5 и его полвергают колонному хроматографированию с использованием активированного угля. Элюирование с колонки с активированным углем проводят с использованием водного изобутанола, однако лучший результат получают при элюировании в нейтральных или слабо-щелочных условиях, которые создают добавлением разбавленного водного раствора аммиака и т.п. Затем полученное в результате соединение подвергают колонной хроматографии с использованием XAD-H ил НР-20. Адсорбированное активное вещество фракционно элюируют водой. Активные фракции собирают и концентрируют, и концентрат подвергают хроматографической обработке на колонке с QAE-Сефадексом А-25 (СЕ -форма) , после чего элюируют 0,02 М водным раствором хлористого натрия. Полученный элюат обессоливают хроматографированием на активированном угле тем же способом, как описано выше. Элюат концентрируют и концентрат подвергают колонной хроматографии с использованием фазы из XAD-11, после чего проводят элюирование и фракционирование водой. Как было установлено, полученные фракции дают единственный пик на жидкостной хроматограмме, как будет показано ниже. Активные фракции объединяют и концентрируют досуха при пониженном давлении, при низкой температуре и к остатку добавляют ацетон или аналогичное соединение -с образованием С-19393 S2. Ферментационный бульон, полученый после завершения культивации, ильтруют с помощью фильтрующего редства для удаления микробиальных ттеток. Полученный в результате ильтрат пропускали через колонку активированным углеродом в нейтальных или слабо-щелочных условиях

и адсорбированный антибиотик С-1939 Hj элюируют с помощью гидрофильной системы растворителей. Поскольку антибиотик Сг-19393 Н является по природе кислым, для дальнейшей очистки с успехом можно применять аниоиообменные,смолы в форме С1 или СНяСОО, такие как Амберит IRA-400, 402, 410, Дууэкс-1, Диаион А-21А и G. Активное вещество, дополнительно элюируют водным раствором хлбристого н атрия или буфферным раствором. Обёссоливание элюата осуществляют его нейтрализацией или слабым подкислением и последующим хроматографированием через активированный

уголь, .с последующим элюированием водным раствором спирта и т.п. Элюат, содержащий активное соедииеиие, концентрируют при пониженном давлении при низкой температуре и к концентраасу добавляют метанол и этанол. Полученный осадок удаляют фильтрацией и полученный в результате водный раствор спирта снова концентрируют при пониженном давлении. Для дальнейшей очистки полученного в результате концентрата с успехом можно применять колонную хроматографию с использованием комбинации DEAE или QAE Сефадекса вС -форме, а также адсорбцион ную смолу XAD или Диаион РН-20, т.е. полученный ранее концентрат пропускают через Диаион HP-2О и фракционно элюируют водой. Активные фракции концентрируют и концентрат пропускают через ДЕАЕ Сефадекс. А-25/се -форма. После промывания 0,02 М водным раствором хлористого натрия,, элюирование осуществляют 0,05 М водным раствором хлористого натрия. Затем полученный в результате элюат пропускают через ДиаионНР-20, который обрабатывают, водным раствором хлористого натрия и элюирвание проводят с помощью водного раствора хлористого натрия, содержащего метанол. Обе,ссоливание элюата проводят с использованием хроматографирования через активированный уголь , тем же способом, что описан выше. Полученный в результате элюат концентрируют и концентрат подвергают колоночной хроматографии с использованием Диаион НР-20 (50-100 меш) и фракциоино элюируют водой Активные фракции сливают и 4 концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с использованием фазы QAE Сефадекс А-25 iCt -форма), которую обрабатывают 0,02 М раствором хлористого натрия-. Фракционирование проводят с использованием 0,04 М водного раствора хлористого натрия и активные фракции обессоливают

тем же способом, что описан выше с .использованием хроматографии через активированный уголь. Элюат концентрируют и концентрат подвергают .хроматографированию на колонке с использованием Avice Э (кристаллическая целлюлоза) - и колонку элюируют и фракционируют 90%-ным водным .раствором пропанола. Полученный элюат концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с XAD-11 (100-200 меш), I по.сле чего проводят элюирование и акционирование водой. Активные фракции концентрируют и концентрат подвергают препаративной жидкостной хроматографии, после чего осущесгв ляют элюирование и фракционирование с помощью метаиолсодержащего фосфат ного буффера. Фракции,. дающие на xpOMaTorpaiv№ie один пик, объединяют и концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колонке с использованием НР-20 (100-200 меш), после .чего проводят элюирование водой для удаления буфера, Элюированные активные фракции кйнцентрируют при пониженном давлении при низкой температуре и концентрат сушат вымораживанием с получением С-19393 Еу в виде белого порсшка.

Соединения изобретения могут обрзовывать соль металла и аммонийную соль. Примерами солей металла могут служить натриевая соль, калиевая .соль, литиевая соль и т.п.

Динатрневая соль С-19393 S, полученная в примере 1, имеет следующие физические и химические свойства: внешний вид - белый порошок; удельное вргицение: (,5, в воде),

Элементарный анализ, % (образец сушили над пятиокисью фосфора при в течение б ч): С 36,29f1,0; Н 3,72tO,5; N ,5; Na 9,70-t il,0; Q 31,09tl,0; S 13,1311,0.

Количество кислорода расчитано . по балансу, т.е. вычитанием содержаний других компонентов.

Молекулярный вес (вычисленный в расчете на содержание 2 атомов Na/на молекулу) 528-429 молекулярная формула,С Н Ы Ыа2Од32. УФ-спектр: спектр, снятый в воде и максимальные значения длин волн были следующие: Д 240 f 12 нм/Е.2 296120/ и 285±2 нм/Е2 245420)

ИК-спектр; спек.тр измеряли с ;образцами в таблетках КВг и имеет основные пики (волновые числа) бы ли слеАукяаими: 3450, 3220, 3000, -1770, 1700, 1630, 1515, 1395,

65 1240-1260, 1100, 1050, 1010, 980, 950, 915, 900j 860, 815, 795, 760 715, 670, 625, 590, 530. (см ). Тонко-слойная хроматография CeCeueose F. Система растворителей. Значение R а)пропана: вода (4:1) 0,3310,1 б)бутанол:уксусная кислота:вода (2:2:1)0,54±0,1 с) пропанол:этанол-вода (5:2:3)0,62tO,l Растворимость: нерастворимы в хлороформе, этилацетате, ацетоне; частично растворимыв этаноле, вутаноле, пиридине; растворимы в метаноле, диметилсульфоксиде, уксусной кислоте; легко растворимы в воде. Цветные реакции: положительная реакция Эрлиха и с перманганатом калия; отрицательная - реакции с нинги-дрином, Грейг-Либака, Драгендорфа, с хлорным железом и реакция Сакагуши. Натриевая соль С-19393 Hj, полученная в примера 2,представленно ниже, имеет следующие физические и химические свойства. Внешний вид - белый порошок. Элементарный анализ (определенный для образца высушенного над пятиокисью фосфора при 40°С в течение 6 ч): С 45,34±1,0; Н 4,98±0,5; N 7,48±0,5; Na 6,15tl,0; 6 8,51ll,0. Молекулярный вес (вычислено в расчете на содержание одного атома Na на молекулу) 426-322. Молекулярная формула NaSOg. Удельное вращение: fo(3.° 134° (с 0,156, в воде). УФ-спектр: измеренный спектр имеет следующие максимальные значен длин волн: Амакс.НО/Е 242+ ±2 нм/395±20) и 28912 нм (314f20) ИК-спектр: спектр, измеренный в таблетке из КВг имеет следующие основные пикН (волновые числа): 3400, 298,0, 2940, 1770, 1630, 1530 1390, 1265, 1215,1130, 1090, 1065 1040, 1000, 920, 840, 820, 790, 7 620, 540, 450/см. Циркулярный dichroism спектр (в вОдеЗ: положительный эффект Кот на при 234 нм и отрицательный эффект Коттона при 206, 258, 292 мм. Тонко-слойная хроматография (с использованием целлюлозы). Система растворителей. Значение R а)пропанол:вода (4:1) 0,45tO,l б)бутанол:уксусная кислота:вода (2:1:1)0,67,tO,l с) бутанол:пиридин: уксусная кислота: вода (15:3:2:12), верхний слой 0,5510,1 Цветные реакции: положительные Эрлиха реакции и с перманганатом калия; отрицательные - с нингидрином, Грейг-Либака, Драгендорфа с хлорным железом и реакции Сакагуши. Растворимость: нерастворим в хлороформе, этилацетате; умереннорастворим в ацетоне, этаноле, и бутаноле; растворим в метаноле и воде. Антибиотики С-19393 S, и Нл относятся к антибиотикам /5 -лактального типа. Антимикробный спектр натриевой соли антибиотика С-19393 82 представлен в табл.2. Таблица 2 Escherichia coti NIHJ 12,5-25 SafmonefSa typhimurium IFO 1252912,5 KEebsieCea pnenmoniae IFO 331812,5 Proteus vuCgaris IFO 3045100 Proteus mirabiCis IFO 384550 Serratia marcescens IFO 1264825 ACcaKigenes faccatis IFO 1311150 Pseudomonas aerugino- sa IFO 30801100 Comamonas ternigend IFO 132996,25 Staphydococcus aureus 209P12,5 Sarcina t utea IFo 323212,5

Продолжение табл.2

subtilis

12,5

i

cereus

100

Среда - бульонный агар.

Антибиотик С-19393 S обладает также сильной бета-лактамаэной ингибирующей активностью и, поэтому, он значительно повышает чувствителность различных бактерий, которые устойчивы к действию производных пинициллина и/или цефалоспорина, к действию этих.агентов.

Антибиотик обладает активностью против грамположительных играмотрицательных бактерий и поэтому он может быть использован при лечении бактериальной инфекции у млекопитащих, например мышей, крыс,собак, людей.

Для использования С-19393 82 при лечении инфицирования микроорганизмом вида E.coti антибиотик растворяют в физиологическом растворе с целью приготовления раствор для инъекций,который можно применять парентерально, например подкожно или внутримышечно при дозе 2-200 мг/кг/день, предпочтительно, 5-50 мг/кг/день. В случае ораль-ного применения антибиотик С-19393 S смешивают с лактозой и капсулируют с целью получения капсульного препарата, который можно применять с дозой 10-500 мг/кг/день, предпочтительно, 20-200 мг/кг/день.

Кроме того, антибиотик С-19393 полученный согласно изобретению, можно использовать в качестве дезинфицирукядего средства. Так, например, жидкий препарат, который может- быть получен растворением антибиотика С-19393 S в дистиллированной воде с концентрацией 0,11,0 вес./об.% или маз ь, содержащая 2-50 мг, предпочтительно, 5-20 мг. С-19393 S2 на 1 г белого петролатума или ланолина в качестве основ может использоваться в качестве бактерицида или дезинфицирующего средс±ва для обработки верхних и нижних конечностей, глаз, ушей и т.п. у указанных выше животных.

Антибиотик С-19393 Sj обладает бета-лактамазной ингибиторной активностью и поэтому, значительно повышает чувствительность пенициллин или. цефалоспорин - устойчивых бактерий к действию ампициллина и

цефотиама из-за его способности производить бета-лактамазу. В соответствии с этим, С-19393 S может использоваться для лечения инфицирования у млекопитающих (например,

у мышей,крыс, собак и людей), а также у птиц (например, куриц, уток), особенно бактериальных инфекций, обязанных действию беталактам-антибиотическиС устойчивых

0 бактерий в комбинации с пенициллином или цефалоспорином.

В том случае, когда антибиотик С-19393 S, используется в комбинации с другими средствами бета-лак5 тамного типа для лечений инфекционных заболеваний,вызываемых, например, бета-лактамантибиотик - устойчивой E.coEi, равные количества С-19393 S и ампициллина растворяют .

Q в физиологическом растворе с целью получения инъекционного раствора, который может применяться парантерально, например подкожно или внутримышечно с дозой 0,1-20 мг/кг/день

5 предпочтительно, 0,5-5 мг/кг/дснь. С-15393 S. может также применяться орально с дозой 1-200 мг/кг/день, предпочтительно, 5-100 мг/кг день, ввиде капсул, каждая из которых содержит равное количество С-19393 S и цефалексин.а.

Если антибиотик С-19393 S используется в качестве дезинфицирующего средства, жидкий препарат, например водный раствор, содержащий ан5 тибиотик С-19393 S .с концентрацией 0,1-10 вес/об.% и бензилпенициллин с концентрацией 0,1-1,0 вес/об.%, или мазь, содержащая 5-20 мг С-19393 S и 5-20 мг бензилпенйцил0 лина на 1 г белого петролатума или ланолина,.в качестве основания, могут использоваться в качестве бактерицида или дезинфецирующего средства для обработки верхних и ниж5 них конечностей, глаз, ушей и т.п. у указанных выше животных.

Антибиотик С-19393 S.является также весьма полезным промежуточным Q соединением для синтеза новых типов фармацевтических препаратов. Антибиотик устойчив в водном растворе в области нейтральны значений рН. .

Физиологические свойства

5

С-19393 Н описаны ниже.

Антимикробиальный спектр натриевой соли С-19393 Е ПРОТИВ различных микроорганизмов представлен в

табл.3 и, как следствие из результатов, представленных в-табл.3, антибиотик С-19393 Н проявляет антибактериальную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Антивактериальнь й спектр дей вий натриевой соли антибиотика С-19393 Н, представлен а табл.3 Т а б л и Минима Микроорганизм ная ин рукнцая центра мг/мл Escherlchia cof i. NIHJ О,§8 Sa$mon& ea typhimu,rivun IFO 125290,31 Kfiebsiefiea pneiiraonlae IFO 33810,31 Proteus vujgaris IFO 3045 Proteus mirabiCis IFO 38455 Serratia marcescens IFO 126480,31 Afcatigenes faecaPis IFO 131115 Pseudomonas aeruginosa IFO 308010 Coraamonas terrigena IFO 132990,16 StaphyEococcusaureus 209P.0,63 Sarclna €utea IFO 3232 .0,31 Bac±Uus subtle is IFO 3S130,31 Bade(Jus cereus IFO 3460 10 Среда - бульонный агар. Как следует из табл.3 антибио С-19393 Hjj , полученный в соотве ствии с изобретением, обладает тимикробной активностью против грамположительных и грамотрицат ных бактерий и, таким образом, жет использоваться для лечения бактериальных инфекций у млекопитакяцих, например у мышей, крыс, собак, людей и пр., а также у птиц, например у куриц, уток и т.п. Для. использования С-19393 Ня в качес уве средства для лечения например, инфекц.ирования E., С-19393 Н. растворяют в физиологическом растворе с целью получения раствора для инъекций, который может применяться паренгерально, например подкожно или внутримышечно, с дозой 0,1-50 мг/кг/день, предпочтительно, 0,5-20 мг/кг/день. В случае о рального применения антибиотик С-19393 2 смешивают с лактозой и капсулируют с целью получения капсульного препарата, который может применяться с дозой 1-100 мг/кг/день7 предпочтительно 5-50 мг/кг/день. Антибиотик С-19393 Н2, полученный согласно изобретению, может . использоваться в качестве дезинфецирующего средства4 Так, например, жидкий препарат, полученный растворителем С-19393vH2 в дистиллированной воде с концентрацией 0,010,1 вес/об.% или мазь, содержащая 0,2-20 мг, предпочтительно, 1-10 мг С-19393 Н на 1 г белого петролатума или ланолина, в качестве основания., может использоваться как бактерицид или дезинфицирующий агент для верхнихи нижних конечностей; глаз, ушей, и т.п. у указанных выше животных. Антибиотик С-19393 Н может быть полезным в качестве промежуточного агента для синтеза новых типов фармацевтических препаратов. Антибиотик изобретения устойчив в водном растворе при нейтральном значении рН. Пример. Культуру штамма Streptomyces С-19393 (1 FO 13886, АТС С 31486) выращивают в 200 мл культуральной среды, помещенной в 1 л Эрленмейровскую колбу с образованием спор. Затем полученные споры суспендируют в стерильной воде с концентрацией 1,210 живых клеток/мл. Споровую суспензию разбавляют стерильной.водой до объема в 10 раз большего, чем начальный объем и 1 мл разбавленной суспензии используют для инокулирования 40 мл посевной среды в 200 мл Эрленмейровской колбе. Инокулироваиную пЬсевную среду затем культивируют в ротационной трясучке при в течение 2 дней. Полученную в резуль- тлте культуру используют, для инокулирования 500 мл посевной среды, помещенной в 2 л колбу Сакагуши и инокулированную посевную среду культивируют в трясучке при в течение. 2 дней. Полученную,таким образом, посевную культуру переносят в 50 л ферментатор из нержавеющей стали, содержащий 30 л посевной среды, содержащей 15 мл Актокола и культивируют при в течении 3 дней, при аэрации со скоростью 30 л/мин и при скорости перемешивания 280 об/мин. Культуральный бульон переносят в ферментатор емкостью 2 м, содержащий 1,2 основной культуральной среды и проводят культивацию при 30°С в течение 5 дней при скорости аэрации 840 мл/мин и скорости перемешивания 180 об/мин. Засеянную среду, используемую выше, дополняют 20 г глюкозы, 30 г растворимого крахмала, 10 г сырой соевой муки, 10 г кукурузного экстракта, 5 г полипептона, 3 г хлористого натрия и 5 г осажденного карбоната кальция на 1 л среды, рН которой устанавливают равным 7,0 перед стерилизацией, а основную культуральную сред используемую выше, дополняют Зо г глюкозы, 30 г растворимого крахмала, 15 г обезжиренной соевой муки, 15 г муки хлопкового семени, 0,25 г первичного кислого фосфата калия, 0,6 г кислого фосфата калия, 0,02 г хлористого кобальта и 0,5 г Актокола на 1 л среды, рН которой устанавливают равным 7,0 перед стерлизацией. Все среды, используемые выше, подвергают стерилизации при

в течение 20 мин.

i

Полученный, таким образом, ферментационный бульон фильтруют с использованием Hyf2о-Superce с получением 1230 л фильтрата, рН которого затем устанавливают равным 6,3 и пропускают через колонку, набитую 100 л активированного угля. Затем антибиотик С-19393 82 и Н элюируют из колонки с помощью 300 л воды и 700 л 7%-ного водного раство pa изобутанола, соответственно.Элюа содержащий С-19393 82, пропускают через колонку с Dowex 1-2 (СЕ-форма, 2 л) и колонку промывают б л вгды и элюируют 32 л 5%-ного водного раствора хлористого натрия. Элюат доводят до рН, равного 5 и пропускают через колонку с 4 л активированного угля. После промывания 12 л воды антибиотик элюируют 7 л 8%-ного водного изобутанола и 12 л смеси 8%-ного изобутанола - N/20 . водного аммиака и полученный элюат концентрируют до объема в 150 мл при пониженном давлении. К концентрату добавляют 1350 мл метанола и осадок, образовавшийся в результате, удаляют фильтрацией. Фильтрат концентрируют до объема 200 мл и пропускают через колонку с фазой из 300 мл DEAE-Сефадекса ; А 25 (С -форма).Колонку последовательно промывают 0,1 М и 0,2 М водными растворами хлористого натрия, (по 900 мл) и после этого антибиотик элюируют 1500 мл 0,4 М водного раствора хлористого натрия. рН элюата устанавливают равным 5 и пропускают через колонку с 500 мл активированного угля. После промывания 1,5 л воды колонку элюируют 2,5 л смеси изобутанола N/20 водного аммиака (8:92) и элюат концентрируют досуха и к остатку добавляют ацетон с образованием 2,4 г светло-желтого порошка-. После растворения порошка в небольшом количестве воды,полученный раствор пропуска1ют через колонку,набитую 1,2 л Ам-. берлита XAD-11 (100-200 меш),и элюируют (фракциями) водой.Фракции,имеjoщиe антибиологическую активность, собирают и концентрируют и концентрат пропускают через колонку |с 200 МП ЦАЕ-Сефадексом А 25 (СГ:форма). После промывания 600 мл 0,1 М водного раствора хлористого натрия, колонку элюируют 1,2 л 0,2 М водного раствора хлористого натрия. Элюат доводят до рН равного 5 и пропускают через колонку с 600 МП активированного угля. После промывания колонки 1,8 л воды, колонку элюируют 3 л смеси 8%-ного изобутанола - N/20 водного аммиака. Элюат концентрируют досуха и добавляют ацетон к остатку с получением 1,07 г порошка. 620 мг полученного, таким образом, порошка растворяют в небольшом количестве воды и полученный раствор пропускают через колонку, набитую 360 мл Амберлита XAD-11 (100200 меш). Затем колонку элюируют и фракционируют водой и каждую из фракций, обнаруживающую антибиологическую активность, анализируют методом жидкостной хроматографии как описано выше, дающие один пик, объединяют и концентрируют досуха и к концентрату добавляют ацетон с получением 136 мг антибиотика С-19393 82 (динатриевой соли) в виде белого порошка.

П.р им е р 2. Элюат антибиотика С-19393 Н2, полученный в примере 1, пропускают через колонку с Доунксом 1-2 (сС -форма, 12 л) и колонку промывают 6 л воды и элюируют 180 л 5%-ного раствора водного хлористого натрия. Полученный элюат пропускают через колонку, набитую 25 л активированного угля. После

промывания 75 л воды желаемый антибиотик элюируют 175 я изобутанола с водой (7:93) и элюат концентрируют до объема в 2-3 л при пониженном давлении. К концентрату добавляют 15 л метанола и полученный, таким образом, осадок удаляют фильтрацией. Полученный фильтрат концентрируют до объема в 2 л и пропускают через колонку с 5 л Диаиона НР-20 (50 меш). Затем колонку элюируют и фракционируют 5 л водаз и 10 л смеси метанол: вода (1:9). Активные фракции объединяют и концентрируют и концентрат пропускают через колонку с 3 л ДЕАЕ-Сефадекс

А-25 (СЕ -форма). Затем колонку промывают 9 л 0,02 М водного раствора хлористого натрия и антибиотик элюируют и фракционируют 12 л 0,05 М раствора хлористого натрия. Активные фракции пропускают через колонку, набитую 2 л Диаиона НР-20 (50 меш), который обрабатывают 4 л водного раствора хлористого натрия, активное вещество элюируют и .фракционируют 10 л смеси метанол: 5%-ный водный раствор хлористого натрия (5:95) и 10 л смеси метанол: 5%-ный водный раствор хлористого натрия (1:9). Активные фракции пропускают через колонку с 500 мл активированного угля и, после промывания 1,5 л воды, элюируют 2,5 л 7%-ного водного изобутанола. Элюат концентрируют и концентрат пропускают через колонку с 1 л Диаион НР-20 (50-110 меш) и злюируют и фракционируют водой. Фракции, обладающие антибиолргической активностью, объединяют и концентрируют и концентрат пропускают через колонку, снабженную 200 мл фазы QAE-Свфадекс А-25 (СЕ -форма) , которую предварительно обрабатывают .400 мл 0,02 М водного раствора хлористого натрия. Затем клонку последовательно промывают О,.02 М, 0,03 М И 0,04 М водными растворами хлористого натрия (по 1 л). Активные фракции пропускают через колонку с 200 мл активированного угля и, после промывания 0,6 л воды, элюируют 1 л 7%-ного водного бутанола. Элюат концентрируют и пропанол добавляют к концентрату с целью получения 90%-ного водного пропанола, который затем подвергают хроматографированию на колоке с Авицелем, который обрабатывают 90%-ным водным раствором пропанолом. Затем колонку элюируют 90%-ным водным пропанолом. Активные фракции концентрируют и концентрат подвергают хроматографированию на колоке с 350 мл Амберлита XAD-11 (100-200 меш) и колонку элюируют

водой. Активные фракции концентрируют и концентрат подвергают препаративной жидкостной хроматографии высокого давления с использованием РР-18 в качестве носителя и проводят элюированием 10%-ного метанола в 0,02 М фосфатном буффере (рН 6,3). Активные фракции пропускают через колонку с 40 мл Диаиона НР-20 (100200 меш) и фракционно элюируют водой.

О Каждую фракцию, обнаруживающую ан-. тимикробиальную активность, подвергают жидкостному хроматографическому анализу, описанному выше. Фракции, дающие один пик, объединяют и

5 сушат вымораживанием с получением 12 мг С-19393 2 в виде белого порошка.

Примерз. 1150 л фильтрата бульонной культуры получают по ме0 тодике аналогичной описанной в примере 1 и его рН устанавливают равным 50 г, пропускают через колонку с100 л активированного угля. После промывания 300 л воды,

5 колонку, элюируют 350 л смеси раствора изобутанола с 0,02 N гидроокисью натрия (8:92).

Полученный элюат пропускают че0 рез колонку, набитую 10л Диаиона SA-21A (еГ -форма) и, после промывания 30 л воды колонку элюируют 100 л 5%-ного водного раствора хлористого натрия. Затем элюат про5 пускают через колонку с 20 л Диаиона НР-20 (50 меш), которую обрабатывают 40 л 5%-ного водного раствора хлористого натрия и колонку элюируют 20 л 5%-ного водного раст0 вора NaCE. Затем антибиотик

С-19393 S и Н элюируютjC колонки 40 л и 60 л смеси метанол: 5%-ный водный раствор NaCg (5:95). Полученный элюат, содержащий анти5 биотик С-19393 S2, доводят до рН равного 5 и пропускают через колонку, набитую 2 л активированного угля. После промывания 6 л воды, колонку элюируют 10 л смеси 8%-ного изобутанола N/20 водного аммиака и полученный элюат концентрируют. Концентрат пропускают через колонку, , набитую 200 мл АЕ-Сефадекса А-25 (Ct -форма), и после промывания 1 л 0,02 М водного раствора хлористого

5 натрия колонку элюируют 1 л 0,4 М водного раствора хлористого натрия. После обессоливания элюита хроматографированием с использованием активированного угля, его под0 вергают хроматографированию через Амберлит XAD-11 и обрабатывают таким жь способом, как и в примере 1 с получением 100 мг динатриевой соли антибиотиком С-19393 в виде бе5 лого порошка.

П р и м е р 4. Йлюат антибиотика С-19393 Hg, полученный з примере 3, доводят до рН равного 5 и пропускают через колонку/ набитую 2 л активированного угля. После промывания б л вощг, колонку элюируют 10 л смеси изобутанол N/20 водный аммиак (8:92) и элюат концентрируют. Концентрат пропускают через колонку с 200 мл фазы QAEСефадёкс А-25 (Ci -форма) и после промывания 1 л 0,02 М водного раствора хлористого натрия, колонку элюируют 1 л -0,04 М водного раствра хлористого натрия. После обессоливания элюата xpo 4aтoгpaфиpoвaнием через активированный уголь, его подвергают хроматографированию на колонке с 200 мл Диаион НР-20 (100-200 меш) и колонку элюируют и фракционируют водой. Фракции, дающие единственный пик на жидкостной хроматограмме, объединяют и концентрируют и концентрат сушат вымораживанием с образованием 48 мг С-19393 Н натриевой соли в виде белого порошка.

Предложенный способ позволяет получить новый антибиотик, который найдет широкое применение: в медиtS цине.