Способ получения холестеринэстеразы Советский патент 1985 года по МПК C12N9/16 C12R1/38 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения холестеринэстеразн

Известен способ получения холестеринэстеразн , предусматривающий культивирование продуцирующего штамм Nocardia cho estero icum NRRL 5767 или NRRL 5768 на питательной среде, содержащей необходимые мине1 альные соли и индуктор - холестериновый эфир или холестерин в количестве 1-10 г/л и экстракт дрожжей с пойледующим выделением фермента. Максимальная активность фермента - 49,2.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения холестеринэстеразн 2J , предусматривающий культивировакие продуцирующих штаммов Pseudomonas fluorescens KY 3955, 4032 .и т.д. на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор - холестериновый эфир с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток. Согласно способу используют питательную среду, содержащую, г/л: холестериновый эфир-5, кукурузный экстракт 2, NaNO, 2, KjHPQ, 1, КС2 0,5 и MgSO, 2. Активность фермента - 17.

Известным способам присущ общий недостаток - низкая активность фермента.

Цель изобретения - повышение активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения холестеринэстеразн, пр едусматривающему культивирование продуцирующего микроорганизма Pseudomonas на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер, и индуктор с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штаммы Pseudomonas spec. DSM 1281 или P seudomonas spec. DSM 1280, a в качестве индуктора - лецитин или соевый лецитин в количестве 0,5-2% от массы среды.

Применяемые в соответствии с изобретением микроорганизмы являются очень похожими и обладают следующие признаки: грамотрицательный; обязательно аэробный; желтоватые колонки на агаре из пептонов мяса; рост при 25, 30 и 37 С; отсутствие роста при 10j более размер клеток от 0,8 до 1 мкм, от 2 до 4 мкм; подвижность, lophotrich begeipelt; склонность к образованию цепей, отсутствие спор или продолжительных стадий: цитохром - оксидаза +; каталаза + ; индол-; нитрит-; желатина моносубстрат - деструкция: адонит + цитрат +; галактоза +; глюкоза +; изонит +; лактоза +; маннит +; манноза +; салицин +; сорбит +.

Процесс культивирования ведут в аэробных условиях при 15-45 С, предпочтительно между 25 и , используя посевные культуры, выращенные на качалке или на воздухе - Pumbersкультуры. Максимальный выход достигается после 1-2 суток культивирования .

Пример 1. Штамм Pseudomona spec, DSM 1280, перенесенный из охлажденной до низкой температуры ампулы в пробирку со скощенным агаром, предварительно культивировали в течение двух суток в основной культуральной среде при 30 С в аэробных условиях (качалочная колба) и затем в количестве до 10% пересевали в среду, которая имела на 1 л воды следующий состав:

Двузамещенный фосфорнокислый натрий7 г Однозамещенньй фосфорнокисльй калий 3 г Хлористьй аммоний 1 г Хлористый натрий 0,05 г 1%-нь1Й раствор хлорного железа 0,1 мл 0,2%-ный раствор хлористой меди . 0,1 мл 1%-ный раствор сернокислого цинка 0,1 мл 10%-нЫй раствор хлористого кальция 1,0 мл 12%-ный раствор сернокислого магния 5,0 мл Соевый лецитин 1,5% РН : 7,0

Культивирование производили при в качалочной колбе при соблюдении аэробных условий. Через 2 суток достигается активность приблизительно 1500 v/л (раствор и биомасса: субстрат : холестерилолеат). Примерно такой же выход получали в том случае, когда при прочих равных условиях вместо Pseudomonas spec. DSM 1280 применяли Pseudomonas .spec. DSM 1281. Пример 2. Из культурального раствора, полученного в соответствии с примером 1, выделяли центрифугированием нерастворимую клеточную массу и применяли ее для определения холестеринового эфира. Определение производили в соответствии со следующей схемой реакций: 1.Холесте- Холестерин-Холестерин+ РИНОВЫЙ+ экстераза кислота Н.О эфир жирного ряд 2.Холесте- Холестери-Холестенонн рин+1/2 0 ноксидаза+ 0 (катализа) Для измерения применяли следующие растворы: 1.Фосфатный буфер 0,5 М, рН 7,5, 0,4% тезита. 2.Холестеринолеат с 4 в тезитдиоксане (v/v 1/1). 3.Hj,0 примерно 0,6 м (5 мл пергидрола/100 мл) . 4.Каталаза (0,01 мг белка/мл). 5.Холестериноксидаза (мин. 50 v/мл). 6.Культуральный раствор (примерно 5000 v/л, 1:5 разбавленный , 0,01 мл- тест). .Для измерения 2,95 мл раствора 1 смешивают с 0,02 мл раствора 3. Через 5 мин добавляют 0,01 мл раствора 6 и 0,02 мл раствора 5 и спустя 1 мин инициируют реакцию добавлением. 0,1 мл раствора 2. Расчет осуществляют по формуле 3,12-51000 „/ . , Т5 5 0 ОТЛЕ/МИН v/л культурального раствора. Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно повысить активность холестеринэстеразн.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНЭСТЕРАЗН, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Pseudomonas на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток, отличающийся тем, что, с целью повьшения активности целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штаммы Pseudomonas spec. DSM 1281 или Pseudoraonas spec, DSM 1280, a в качестве индуктора лецитин или соевый лецитин в количестве 0,5-2% от массы среды. (Л