Способ приготовления биферментного электрода для определения сахарозы Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/00 

00 ( ел о ел

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способам изготовления ферментных электродов для определения сахарозы в биологических средах, и может быть использовано в медицине, пищевой и микробиологической промьшленности.

Цель изобретения - упрощение способа и улучшение качества электрода за счет поБьшения воспроизводимости его характеристик.

Способ осуществляют следуюпшм образом.

Пирографитовый электрод выдержива- ют в растворе акриламида К,ы -бис- метиленакриламида и глюкозооксидазы при потенциале (-1,1) - (1,2)В (относительно водородного электрода в том же растворе), а затем переносят в водный раствор поливинилового спирта, содержащего борную кислоту и инверта- зу и также выдерживают при потенциале (-1,1) - (-1,2)В. Время, в течение которого необходимо выдерживать элект род в том и другом растворе, зависит от того, какой толщины мембрану нужно получить и может изменяться от 10 с до 3-5 мин. В процессе поляризации электрода при данном потенциале на электроде адсорбируется глюкозоок- сидаза и образуется мембрана из поли- акркламидного геля, содержащая глюко- зооксидазу, включенную в мембрану, В растворе поливинилового спирта, содержащего борную кислоту и инвертазу при катодной поляризации происходит подщелачивание приэлектродного слоя в результате вьщеления водорода, в результате изменения рН происходит сшивание поливинилового спирта анионами борной кислоты (тетрагидроксобо- рат-анионами), Образующаяся мембрана поливинилового спирта содержит инвертазу, включенную в объем мембраны. Мембрана из поливинилового спирта в процессе работы может растворяться, поэтому для повьппения ее стабильности производят сщивание глутаровым альдегидом.

Методика изготовления электрода упрощается, так как процесс осуществляется в одНу стадию, а также повьша- ется активность и воспроизводимость характеристик электрода благодаря тому, что адсорбируется большее чество ферментов, которые равномерно распределяются на поверхности электрода и по толщине мембраны, кроме то

Q

j Qз „

5

0

45

го, мембрана достаточно тонкая и равномерная по толщине и характеристики ее воспроизводятся от опыта к опыту.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример I. Пирографитовый электрод опускают в ячейку с водным раствором, содержащим г/л: акриламид 350; N,N бис-метиленакриламид 25; хлорид цинка 20; глюкозооксидаза-О,5. На пирографитовом электроде поддерживают потенциал, равный -1,1 В относительно водородного электрода в том же растворе, противозлектрод - анод используют из пластины или нержавеющей стали. Процесс ведут при комнатной температуре в течение 2 мин. Затем электрод промывают водой и опускают в ячейку с водным раствором, содержащим, г/л: поливиниловый спирт 80; борная кислота 4; инвертаза О,6.Электролитом служит ацетатный буферньй раствор рН 5,0, На пирографитовом электроде поддерживают потенциал -1,1 В, Процесс проводят 15 с. После этого электрод промывают и помещают в раствор глутарового альдегида для сшивания поливинилового покрытия. Раствор для сшивания содержит 0,125 мас.% глутарового альдегида и 14,0 мас,% хлорида натрия в воде.

Толщина образующейся мембраны в выбранном интервале времени составля-- ет 25 мкм.

I

Примеры 2-5. Все операции,

как в примере 1, кроме потенциала, при котором проводили получение мембраны на электроде. Потенциал составляет для примера 2 - (1,15)В; 3 - (-1,2)В; 4 - (-1,05)В; 5 - (-1,25)В.

Активность и воспроизводимость характеристик по тученных электродов оценивают как по скорости ферментативной реакции, так и величине тока, отвечающего превращению пероксида водорода, образующегося в результате последовательных реакций.

Реакции, протекающие в бифермент- ной системе, могут быть представлены следующим образом:

Инвертаза, иммобилизованная во внешнем слое мембраны, осуществляет реакцию превращения сахарозы:

инвертаза

Сахароза + НО тоза + oi. -D-Глюкоза

Фрукв результате мутаротации oi-D-глюкоза

превращается в -D-глюкозу, которая является субстратом глюкозооксидазы.

Глюкозооксидаза, иммобилизованная во внутреннем слое мембраны, осуществляет окисление глюкозы с образованием пероксида водорода по реакции:

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к способам изготовления ферментных электродов для определения сахарозы в биологических средах, и может быть использовано в медицине, пищевой и микробиологической промышленности. Цель изобретения - упрощение способа и улучшения качества электрода за счет повышения воспроизводимости его характеристик. Способ заключается в следующем: пирографитовьй электрод выдерживают в растворе акриламида N,N -бис-метиленакриламида и глюкозоо- ксидазы при потенциале (-1,)-(- ,2)В, а затем переносят в водный раствор поливинилового спирта, содержащего борную кислоту и инвертазу и также вьщерживают при потенциале (-1,1) - (-1,2)В, а затем обрабатывают Мембрану глутаровым альдегидом. Способ позволяет упростить процесс получения электрода, а также улучшить его качество за счет повышения воспроизводимости его характеристик. 1 табл. о S (Л

Р

-D-Глюкоза + О, +

Образующуюся , оценивают спект- рофотометрически, добавляя в раствор иодид калия, который окисляется пе- роксидом водорода с образованием KJj. Количество образующего комплекса KJj определяют при длине волны 350 нм.Величина оптической плотности служит мерой ферментативной активности электрода. Электрохимически активность ферментного электрода оценивают по величине тока, измеренного при потенциале +0,6В (относительно хлорсеребря ного электрода сравнения), отвечающего -восстановлению пероксида водорода и пропорционального концентрации сахарозы в растворе.

В таблице представлены данные по активности и воспроизводимости характеристик электродов, полученных по предлагаемому и известному способам.

Результаты, представленны в таблице, показывают, что электрод, изготав ливаемый по предлагаемому способу, имеет более высокую активность и воспроизводимость. Способ проще и быстрее.

Снижение характеристик электрода при выходе за область предлагаемых потенциалов о.бусловлено тем, что при потенциале менее отрицательном, чем -1,1 В полимерные мембраны вообще не образзпотся, а при потенциалах отрицательнее -1,2 В начинается интенсивное выделение водорода, которое так

0,08 0,32 0,34

Глюкозооксидаза

Глюконовая кислота +

15

же препятствует образованию мембраны 10 и адсорбции фермента.

Характеристики биферментных электродов, изготовленных по предлагаемому способу, сохраняются в течение месяца, что позволяет пгароко применять их для определения сахарозы в медико- биологических исследованиях.

Кроме того, в предлагаемом способе отсутствует стадия закрепления мембраны на электроде, поскольку иммоби- 0 лизация и закрепление мембраны осуществляются в одну стадию.

Формула изобретения

2 Способ приготовления биферментного электрода для определения сахарозы, включающий иммобилизацию глюкозооксидазы и инвертазы в мембрану и закрепление мембраны на электроде, о т - 30 личающийся тем, что, с целью упрощения способа и улучщения качества электрода за счет повышения воспроизводимости его характеристик, иммобилизацию ферментов и закрепле35 ние мембраны проводят одновременно, выдерживая электрод при потенциале (-1,1) - (-1,2) В последовательно в растворе акриламида и Ы,ы -бис-мети- ленакриламида, содержащего глюкозоок40 сидазу, а затем в растворе поливинилового спирта, содержащего инвертазу, а полученную мембрану обрабатывают глутаровым альдегидом.

20-25 10-12 10-1 1

5-6 5-6 5-6

Значения тока измерены через 1 мин после наложения потенциала на электрод в растворе сахарозы в концентрации М. Приведены средние значения токов для 10 независи- .мых электродов. Воспроизводимость характеристик оценивали по формуле:

S ср . 100%

ср Л„ получена для 10 электродов данного типа.

Продолжение таблицы