со со
00
J
Изобретение качается замещенных имидазола, в частности получения oi , об-бис- (4-хлорфенш1)-4 (5)-имидазолметансла, обладающего способностью ин- гибировать фермент ароматазу, что может быть использовано для лечения и профилактики эстроген-зависимых заболеваний, в особенности рака молочной лселезы у млекопитающих. Цель - создание нового вещества указанного класса с нехарактерной для него активностью. Синтез ведут из соединений формул I и II: N CH-NH-CH C-C(0)OZ (I) С1
СП
Изобретение относится к способу получения новых производных имидазола (Обладающих способностью ингибировать фермент ароматазу, которые могут быть использованы для лечения и профилак- Гики экстроген-эанисимых заболеваний, В особенности рака молочной железы у млекопитающих.
Цель изобретения - синтез новых ПРОИЗВОДНЫХ имидазола, обладающих ак- |гивностью в качестве ингибиторов аро- 1| атазы, свойство, которое не проявля- ta соединения аналогичного строения.
Пример. Д(5)-/бис(4-фтор- фенил)ме тил/-1Н-имида зол.
Прибавляют 9,2 г п-щрида натрия в биде 57%-ной дисперсии в масле к раст ору 22 г имидазола в 200 мл диметил- ||юрмамида при перемешивании. После Окончания реакции, что видно по прекращению вспенивания, при перемешивании прибавляют 22 г 4,4-дифтордифе- нилметилхлорида. Смесь два часа пере- р ешивают при комнатной температуре. 1и затем 1,5 ч нагревают на паровой бане. Смесь выпивают в смесь льда с водой, прибавляют эфир и разделяют слои. Водный слой промывают эфиром, объединенные эфирные экстракты про- мывают водой, сушат над сульфатом магния, фильтруют и выпаривают. Остаток ;хроматографируют на силикагеле, элюи- ;руя последовательно 10% этилацетата IB толуоле, 20% этилацетата в толуоле и смесью 1:1 этилацетата и толуола (по 2 л каждой смеси), чтобы получить ; 1,2 г 2-/6ИС-(4-фторфанил)метил/ими- дазола (,44, силикагелевые пластины для тех, элюирование смесью 1:1 этилацетата и толуола), 14,5 г 1-/бис (4-фторфенил)мвтил/имидазола (Rf «. 0,30) и 1,99 г целевого 4(5)-/бис- (4-фторфенил)мети.п/имидазола (Rf 0,15). Структуры были подтверждены , ЯМР и ИК-спектроскопией.
П р и м е р 2, 4 (з)-/(4-хлорфенил) (4-фторфенил)метил/имидазола.
Работают по методике примера 1, целевое соединение получают из имида- зола и 4-хлорфенил-4-фторфенилметил- хлорида с выходом 3,1%,
И р и м е р 3.ci ,а;,-Бис-(4-хлорфенил)-4 (5) -имидазолметанол.
Готовят реактив Гриньяра из 4,7 г магниевых опилок, каталитического количества (четыре капли) 1,2 дибром- этана в 2 мл диэтилового эфира и
с
5
0 5 О c0 5
О
5
25,0 г 4-бромхлорбензола в 100 мл тет- рагидрофурана. После примерно двух часов перемешивания прибавляют 5,0 г метил-4-имидазолкарбоксилата в виде раствора в 50 мл тетрагидрофурана. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение часа. Отгоняют тетра- гидрофуран и оставшуюся смесь выливают в ледяной раствор хлористого аммония и экстрагируют этилацетатом. После выпаривания экстракта получают желтое масло, которое очищают хроматографией на силикагеле, элюируя с градиентом этилацетата 15%-ный метанол в этилацетате. Соответствующие фракции собирают, объединяют, вьшаривают и кристаллизуют из этилового эфир - гексана, получают 6,47 г целевого продукта. Перекристаллизовывают 1 г материала из бензола, получают 540 мг продукта,с т.пл. 110-113 С. Анализ для С, Н С1,, j Вычислено: С 60,41; Н 3,79; N 8,78; С1 22,21.
Найдено,%: С 59,99; Н 4,03; N 8,54; С1 22,29,
Соединения изобретения являются полезными для профилактики и лечения эстроген-зависимых заболеваний, включая рак молочной железы у млекопитающих, благодаря их способности
ингибировать ароматазу была показана при применении модификации метода Броди, выделенных микросом яичников крыс. В этой тестовой системе микросомы яичников получали из крыс, обработанных гонадотропиновой сьгоорот- кой беременных кобыл. Испытуемые соединения прибавляли в реакционные колбы, содержащие О,1 мкМ 4-андростен- 3,17-диона, 100000 дпм 1,2(Н)-андро- стендиода, микросомы и NADPH генерирующую систему. Концентрация испытуемых ингибиторов находилась в интервале между 0,005 и ЮмкМ.. В этом опыте ароматизация андростендиона приводит в результате к получению ( Н)-Н20, которую вьзделяют экстракцией образцов хлороформом и обработкой водной фазы активированным углем для удаления свободного стероида. Образцы обсчитывают на жидкостном сцинтилляционном спектрометре и определяют процент ин- гибирования по сравнению результатов с контрольными образцами, инкубированными без ингибитора. Мощность определяют, основьшаясь на концентра
ции ингибитора в мкМ, требующейся для получения 50% ингибирования ферментов активности (), когда концентрация субстрата (андростендиона) составляет 0,1 мкМ. Величины ЕС для некоторых соединений приведенной выше формулы сведены в табл.1.
Благодаря своей способности инги- бировать фермент ароматаэу соедине- кия предлагаемого изобретения способны ингибировать синтез эстрогенов у млекопитающих, что делает эти соединения полезными при лечении эстроген- зависимых заболеваний, таких как рак молочной железы. Эта активность была показана in vivo на следующей тесто вой системе,
Ингибирование синтеза эстрогена у крыс.
Неполовозрелые самки крыс Вистар (45-55 г) были разделены на контрольную и тестовые группы по 4-5 животных в каждой. Испытуемые соединения вводили семь дней ежедневно путем ис- кусственного кормления в кукурузном масле. Контрольные животные получали кукурузное масло без испытуемого соединения. Начиная с четвертого дня испытаний всем животным, обработанным испытуемым соединением, и половине контроль ных животных делают подкожную инъекцию ,О мг тестостерон пропиона- та в кукурузном масле. Оставшиеся г контрольные животные получают только эквивалентный объем.кукурузного масла На седьмой день испытаний крысы, обработанные тестостерон пропионатом, получают подкожно 100 мкКю (Н)-тестостерона в 50 мкл смеси 3:1 (объем/ объем) солевого раствора и этанола.
Через два часа животных умерщвляют отрезанием головы. Изолируют матку обрезают чуждую соединительную ткань и взвешивают. Как суммировано в табл.2 у животных, обработанных кукурузным маслом, вес матки меньше, вни представляют собой нестимулированный или негативный контроль. У контроль- нь1Х животных, обработанных тестостерон пропионатом, эстрогены, продуцированные ароматизацией, стимулируют матку, приводя в результате к увеличению ее веса. Соединения, которые ингибируют прохождение ароматизации, заметно снижают вес матки по сравнению с контролем, обработанным тесто- стеронОм.
Яичники крыс, обработанных ( Н)- тестостероном, вырезают, очищают от чужеродной ткани и гомогенизируют Р 2,5 мл 1,0 мМ калийфосфатного буфера, содержащего 3,0 мМ , 320мМ сахарозы и 0,25% Тритона Х-100 (п- изооктилфениловый эфир полиэтиленгли- коля. Ром энд Хаас) при рН 6,5. Экстрагируют стероиды яичников I,5 мл смеси 9:1 (объем/объем) толуола и этанола, к которой было прибавлено 250
ю 5
0
00 мкг каждого чз немеченных экстра- диола-, эстриола и эстерона, и прибли15 зительно 1000 дпм ( )-эстрадиола. Образцы подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют при 500 g в течение 10 мин и органическую фазу переносят в коническую колбу. Проводят две дополнительных экстракции по той же методике. Собранные органические экстракты вьтаривают для последующей тонкослойной хроматографии.
Осаждают белки яичников добавлением 5,0 мл этанола к оставшейся водной фазе. После инкубирования в течение ночи при 4°С образцы центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин. Надосадочный слой отбрасывают и шарик осадка растворяют в 0,3 н гидрок- сидс калия. Определяют белок по методике Бретфорда.
Повторно растворяют органический Остаток из каждой из проведенных выще
р; экстракций в смеси 9:1 (объем/объем) дихлорметана и метанола. Раствор каждого образца наносят на отдельную си- лик агелевую пластину для тонкослойной хроматографии, которая содержит флюо0 ресцирующий .индикатор. Пластины проявляют сначала смесью 160:38:1,5:0,5 (объем/объем/объем/объем) дихлорметан- этилацетат(-метанол)уксусная кислота на расстоянии 3 см от верхней части
5 пластины. После суппси на воздухе пластины проявляют вторично в смеси 180:19:1 (объем/объем/объем) дихлор- метан(метанол)гидроксид аммония. Пластину сушат на воздухе и исследуют
Q при 254 нм в УФ-свете.
Отмечают видимые пятна и пластины обрызгивают примулином (0,001% в смеси 4: объем/объем ацетон-вода) по методике Райта, которая позволяет вден5 тифицировать дополнительные стероиды
при 365 нм УФ-света. 1
Пятна соскабливают с пластины, используя пипетку Пастера, заполнен
w стекловатой, присоединенную к вакуумной линии. Стероиды элюируют непосредственно в сцинтилляцнонные колбочки добавлением 0,2 мл дихлорметана после двух промывок, каждая по мл метанола. Выпаривают органический растворитель и в колбочки добавляют 10,0 мл сцинтилляционной ЖИДКОСТИ (Бексан-Риди Сола NA), Об- рйзды анализируют с помощью жидкост- н0й сцинтилляционной спектрометриио КЬррекдию делают на основе извлече- ()--стероида о Концентрации сте- рЬидов выражают как фемтомоли на мил- литрами белка.
Соединения.предлагаемого изобретения могут быть введены любым из многочисленных путей, включая ораль- НЬ1Й, подкожный, внутримышечный, внут- ривенный, через кожу и ректальный, соединения обычно применяют в виде (}:|армацевтических композиций. Такие к|омпозиции готовят по хорошо известным методикам и они состоят из пример но 1-95 мас.%, по крайней мере, одно- активного соединения указанной вы- Ше формулы (I).
Такие фармацевтические композиции содержат в качестве активного ингредиента соединение указанной выше формулы и фармацевтически приемлемый носитель. При изготовлении композиций Активный ингредиент должен быть хо- смешанным с носителем, или разбавляется носителем, - или же заключен внутри носителя, который может быть 4 виде капсул, мешочков, бумаги или Другого контейнера, Когда носитель служит в качестве разбавителя, он может быть твердым, полутвердым или Жидким материалом, который работает как носитель, экципиент или среда для активного ингредиента. Так, композиции могут быть в виде таблеток, пилюль, порошков, лосьонов, саше, облаток, эликсиров, эмульсий, растворов, сиропов, суспензий, аэрозолей (как и твердой, так и в жи;чкой среде), ма- шей, содержащих по крайней мере 10 мас.% активного соединения, мягких или твердых желатиновых капсул, суппозиториев, стерильных растворов для инъекций и стерильных расфасованных порошков.
Некоторыми примерами подходящих носителей, экципиентов и разбавителей являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмалы, камедь
фосфат кальция, альгинаты, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, целлюлоза, трагант, желатин, сироп, метилцеллю- лоза, мети- и пропилоксибензоаты, тальк, стеарат магния, вода и минеральное масло о Композиции могут дополнительно содержать смазки, смачивающие агенты, эмульгаторы и суспензирующие агенты, консерванты, подсла- щиватели или ароматизирующие агенты. Композиции могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить быстрое поддерживающее или замедленное выделение активного ингредиента после введения пациенту при использовании процедур, известных на данном уровне техники.
Для орального введения соединения предлагаемого изобретения могут быть смешаны с носителями и разбавителями, сформованными в таблетки или заключенными в желатиновые капсулы. Альтернативно смеси могут быть растворены в жидкостях, таких как 10%-ный вод- ньй раствор глюкозы, изотонический солевой раствор, стерильная вода или т.п., и введены внутривенно или инъекцией. При желании такие растворы могут быть лиофилизированы и храниться в стерильной ампуле, чтобы их можно бьшо легко перевести при добавлении стерильной воды в раствор для внутри-
мышечной инъекции.
Соединения предпочтительно формуют в виде единичных форм дозы, каждая доза содержит примерно от 1 до 500 мг обычно 5-300 мг активного ингредиента. Термин единичная форма
5
дозы относится к физически дискретным единицам, пригодным для однородной дозировки людям и другим млеко питающим. Каждая единица содержит заранее определенное количество активного материала, рассчитанное для получения же-паемого терапевтического эффекта, вместе с требуемым фармацевтическим носителем.
50
Активные соединения являются эффективными в широком интервале доз. Например, дневные дозировки обычно на- ходятся примерно в интервале 0,05 - gg 300 мг/кг веса тела. При лечении взрослых людей предпочтительным является примерно интервал 0,1 - 50 кг/кг в виде единичной дозы или отдельных доз. Однако должно быть понятно, что
количество действительно вводимого соединения должно определяться врачом в зависимости от релевантных условий,, включая состояние пациента, выбор с вводимого соединения, возраст, вес и реакцию индивидуального пациента, тяжесть симптомов у пациентов и выбор пути введения, поэтому приведенные вьше интервалы ни в коей мере не огра 10 ничивают область изобретения.
Для более полной иллюстрации работы предлагаемого изобретения приводятся примеры рецептур. Примеры явля- . ются иллюстративными и ни в коей ме- 15 ре не ограничивают область изобретения. В рецептурах применяются любые из фармацевтических соединений указанной вьше формулы.
Полученные соединения относятся к 20 категории малотоксичных.
Соединение примера 3 сравнивают с (оЬ,(-бис- (2-метилфенил) -1 Н-имидазол- 4-метанол)по методике испытаний in
vitro,ЕС so для соединения предлагае- 25 мого изобретения составляет 0,028 MKMj а для сравнительного соединения - 1,075 мкМ. Это доказьшает преимущество в отношении биологической активности предлагаемых соединений перед 30 известными.
Концентрация соединения в мкМ, требующаяся для достижения 50%-ного ингибирования активности аромата- зы при концентрации субстрата О, 1 мкМ.
Влияние соединения формулы (I) на уровень стероидов и вес матки приведено в та бл.2.
Формула изобретения
Способ получения ы, ,о.-бис-(4-хлор- фенил)-4 (5)-имвдазолметанола формулы
ОН
о т
щ и и с я тем, что
соединения формулы
--TrCOOZ
J 1T-J
н
где Z - С,- С4-алкил; подвергают взаимодействию Гриньяра формулы
где X - хлор или бром;
с вьщелением целевого продукта,
Т а б л и ц а 1
f ci (4-Хлор- ф.енил) -4 (5) имидазолметанол
Контроль, обработанный тестостероном
Контроль - кукурузное масло
мг/кг п.о. искусственное кормление. Фетмомоли на мшшиграмм белка.
Существенное различие по сравнению с контролем, обработанным тестостероном, рН 0,05.
Составитель Г.Жукова Редактор Г.Гербер Техред Л.Кравчук корректор М.Шароши
Заказ 2609/58
Тираж 370
ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,,д. 4/5
Таблица 2
217,8
0,40
0,07
0,165
93,0
Подписное
| Вацуро В.К., Мищенко Г.Л | |||
| Именные реакции в органической химии | |||
| - М.: Химия, 1976, с.154. |
