(21) (86) (22) (31) (32) (33) (46) (71) (72)
3624508/28-14 РСТ/Ни 82/00064 26.07,83 3594/81 01.12.81
ни
23.06.88.
(30.11.82)
Бюл. № 23
Эдьт Дьёдьсерведьесети Дьяр (HU) Илона Белади, Миклош Тот, Ишт- ван Ростоци, Шандор Тот и Валериа Эн- дрес (ни)
(53) 615.45(088.8) (56) J. Immunol, 1980, 10, 877. Virology, Т961, 14, 359.
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГАММА-ШТЕРФЕРОНА
(57) Изобретение относится к медици- .не, точнее к фармацевтической промышленности, а именно к получению v-интерферона. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта путем дополнительной обработки лейкоцитов или -интерфероном в количестве 500-5000 IE/мл в течение 1-12 ч. Затем обрабатывают лейкоциты митогене- ,. тическим агентом И центрифугируют. Удаляют эритроциты 0,83-0,89%-ным водным р-ром хлористого аммония, Суспендируют лейкоциты в питательной среде, содержащей хлористый кальций, нитрат железа, хлористый калий, сульфат магния, гептагидрат, хлористый натрий, кислый углекислый натрий, дигидрат однозамещенного фосфата натрия и глюкозу.
О)
с
ел
Од СО
СМ
; Изобретение относится к области медицины, в частности к фармацевти- 1ческой промышленности гамма-интерферона. I Целью изобретения является повы- иение выхода целевого продукта за счет дополнительной обработки лейког, цитов альфа- или бета-интерфероном.
Способ осуществляется следующим образом.
Пример 1, Кровь, полученную в растворе ЛКД (водньй раствор, содержащий лимонную кийлоту и декстрозу) ,хранят в течение 3 ч при тем- пературе , Фракцию лейкоцитов отделяют центрифугированием и оставля- ;от стоять в течение ночи при темпе- эатуре . Затем одну съемную часть полученного таким образом концентра- га лейкоцитов смешивают с 5 мае,ч, ),89%-ного водного раствора хлористого аммония при температуре 4°С л вьщерживают суспензию до полного ;застворения эритроцитов (обычно этот лроцесс заканчивается через 5-10 мин 1осле чего лейкоциты отделяют центри ()угированием Ич суспендируют в питательной среде следующего состава, мг/л:
Хлористый кальций 265 Нитрат железаО,1
Хлористый калий 400 Сульфат магния,
.гептагидрат200
Хлористый натрий 6400 1 Кислый углекислый I натрий2750
Дигидрат однозамещенного фосфата
натрия 140
Глюкозл4500
После этого вновь проводят удале- i|iHe эритроцитов, используя при этом |0 . 0,83%-ного водного раствора :|шористого аммония. Лейкоциты. суспен ;(щруют в питательном растворе, довод Концентрацию клеток в нем до 0 кле фок/мл, В питательный раствор, кроме }|пказанных ингредиентов, добавляют i мг/мл агамной сыворотки человека и :И мкг/мл неомицина. Полученные кает |си подвергают обработке в течение 4 ч при температуре 37°С и постоянг перемешивании альфа-интерфероном количестве 1500 IE, обработанным Предварительно при рН 2,0 для удале- )я из него вируса Sendai, Затем ьфа-интерферон удаляют путем двухкратного промывания клеток раствором Хзнкса и добавляют к ним конкавалин в количестве 15 мкг/мл, выдерживая их при температуре в течение 12 ч. После этого клетки отделяют от надосадочного слоя центрифугированием Выхдд гамма-интерферона в неочищенном надосадочном слое равен 1666 IE/МП.
Для сравнения процесс проводили таким же образом, но перед добавлением индуктора лейкоциты не подвергали предварительной обработке альфа- интерфероном. В этом случае выход гамма-интерферона равен 216 lE/ivui,
Пример 2, Процесс проводят по примеру 1 с той лишь разницей, что в качестве питательного раствора используют среду MEM типа Hasgow (Virology, J4, 359, 1961), при этом выход гамма-интерферона в неочищенном виде составляет 1600 IE/мл,
Описанньй процесс повторяют за исключением стадии обработки альфа- интерфероном. Содержание активного вещества в неочищенном интерфероне, получевном таким образом, равно лишь 206 IE/мл,
Пример 3. Процесс.проводят по примеру 1 с той разницей, что используемый для дополнительной обработки альфа-интерферон не удаляют. Обработанные альфа-интерфероном клетки выдерживают в присутствии конка- валина А (концентрация 15 мкг/мп) при 37 С в течение 12 ч при постоянном перемешивании. Содержание интерферона в надосадочной жидкости составляет 1733 IE/мл,
Полученный в результате продукт, содержащий альфа- и гамма-интерферон разделяют на отдельные компоненты с помощью хрЬматографии. Для этого сырой продукт вводят в колонку, заполненную насадкой из CPG-стекла. Альфа интерферон и примеси проходят через колонку, а гамма-интерферон задерживается, Элюирование гамма-интерферона осуществляют с помощью водного раствора, содержащего 20 об,ч« эти- ленгликоля, 150 ммоль хлористого натрия и 20 ммоль фосфатного буфера.
Пример 4, Процесс проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что для предварительной обработки вместо альфа-интерферона используют 2500 IE/мл бета-интерферона. Содержание гамма-интерферона в пЬлучаемом
при этом сыром продукте составляет 1866 IE/МП.
Повторяют описанный процесс за исключением стадии предварительной обработки бета-интерфероном. Содержание активного вещества в неочищенном интерфероне, полученном таким образом, составляет 226 IE/мл.
Пример 5. Получение гамма- интерферона проводят по примеру 1 с той лишь разницей, что предваритель ную обработку проводят альфа-интерфероном в концентрации 500 1Е/мп, при этом гамма-интерферона получено в количестве 700 IE/мл.
Пример 6. Процесс проводят по примеру 1, только для предварителной обработки использунзт бета-интерферон в концентрации 500 IE/мл, при этом выход гамма-интерферона составляет 1000 IE/мл.
Пример 7. Процесс проводят по примеру 1 с той лишь разницей, что для обработки лейкоцитов используют альфа-интерферон в концентрации 5000 IE/МП, при этом выход гамма-интерферона составляет 300 IE/мл.
Пример 8. Получение гамма- интерферона проводят по примеру 1, при этом обработку лейкоцитов проводят бета-интерфероном .концентрации 5000 IE/мл. Выход гамма-интерферона в данном случае составляет 1000 IE/м
При проведении обработки лейкоцитов альфа- или бета-интерферонов в течение 30 мин, а не 4 ч как в примере 1, производство гамма-интерферона снижается при этом от 1500 до
1А05691
250 IE/МП, а проведение ее в течение 15 ч не превьшает выхода гамма-интер- . .ферона, равного 1550 IE/мл.
Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что благодаря предварительной обработке . или бета-интерфероном, выход гамма- интерферона возрастает в 5-10 раз. ич По своим физико-химическим свойствам (чувствительности при рН 2,0; стабильности, определенной при 56 и ) и биологической активности (антивирусное и противоклеточное действие), полученный предлагаемым способом гамма-интерферон полностью эквивалентен гамма-интерферону, полученному известным способом.
Формула изобретения
Способ получения человеческого гамма-интерферона путем вьщеления з крови фракции лейкоцитов, удаления эритроцитов, суспендирования ейкоцитов в питательной среде, с последующей обработкой их митогене- тическим агентом и отделением клеток центрифугированием, о т л и - чающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, удаление эритроцитов проводят 0,83 - 0,89%-ным водным раствором хлористого аммония, а перед обработкой мито- генетическим агентом лейкоциты.обрабатывают альфа- или бета-интерфероном в количестве 500-5000 IE/мл в течение 1-12 ч.
