Способ определения активности пероксидазы Советский патент 1986 года по МПК G01N21/78 

ю

о to

со

СД Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения ак- , тивности пероксидазы, и может быть использовано в биологии, токсикологии, медицине. Цель изобретения - повышение чувствительности способа за счет использования в качестве субстрата сме си пирокатехина и резорцина. Способ осуществляется следующим образом. В кювету спектрофотометра последовательно вносят 1 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,3-8,0; мл 0,04 0,07 М раствора пирокатехина; 1 мл 0,02-0,03 М раствора резорцина; 0,5 мл раствора, содержащего перокси дазу. Реакцию инициируют добавлением 0,5 мл 0,03%-ного раствора перекиси водорода. После быстрого перемешивания реагентов определяют увеличение оптической плотности при 460 км. Активность фермента в условньтх единицах А f7c о тическая ПЛОТНОСТЬ} t - время, мин; f оптическая толщина кюветы, см; С концентрация фермента, мг/мл. Пример 1. Определяют активность пероксидазы фиры Реанал. В кювету вносят 1 мл фосфатного буфера рН 7,5; 1 мл 50 мМ пирокатехина, 1 мл 25 мМ резорцина: 0,5 мл пероксидазы ( 2 мкг/мл в фосфатном буфере); 0,5 мл 0,03%-ного раствора перекиси водорода и измеряют оптичес кую плотность при 460 нм. AD Oj62; f 1 см; t 1 мин; С 0, мг/мл; А uD/t -C 2480 усл.ед. Пример 2. Измерение провод аналогично примеру 1, за исключение того, что рН 7,25, концентрация пирокатехина 40 мМ, резорцина 20 мМ D 0,57; t 1 МИН.1 1 1 см; С 0,25 10 мг/мл; А D/t 1 С 2280 усл.ед. Прим е--р 3. Измерение проводят аналогично примеру 2, за исключением того, что рН 8,00, концент ация пирокатехина 70 мМ, резорцина 0 мМ. uD 0,55; t 1 мин; Е i см; С 0, мг/мл; А uD/t-I-C 2200 усл.едПример 4. Определение активности пероксидазы в элодее канадской. Навеску элодеи 500 мг сырого веса растирают в фосфатном буфере 0,01 М, рН 7,50, переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят до метки центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Измерения проводят согласно примеру 1, но вместо 0,5 мл раствора пероксидазы в кювету помещают 0,5 мл вытяжки. Во втором варианте навеску элодеи предварительно инкубируют в течение 30 мин в растворе ингибитора пероксидазы - 10 М сульфида натрия, затем элодею отмывают и определяют активность фермента аналогично указанному. Расчет проводят на 1 г/мл сырого веса элодеи. Активность пероксидазы нативной элодеи, AD, 0,52 ±0,06; t 1 мин; f см; С - вес/объем 0,5:8:25 0,0025 г/мл (С - концентрация растительного материала в кювете). А iD,-/tJ-C 208 усл.ед. Активность пероксидазы элодеи после обра.ботки ингибитором. DZ 0,29 ±0,04; t мин; F 1 см; С 0,025 г/мл; А uD /t-1C 116 усл.ед. Формула изобретения Способ определения активности пероксидазы путем инкубации пробы, со-- держащей пероксидазу, перекись врдорода и окисляемьш субстрат, с последующим измерением оптической плотности смеси, отличающийс я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве окисляемого субстрата используют смесь, содержащую 40-70 мМ пирокатехин и 20-30 мМ резорцин, а определение ведут при рН 7,25-8,00.

Изобретение относится к биохиMiTO. Цель изобретения - повьппение чувствительности способа за счет использования в качестве субстрата смеси пиротсатехина и резорцина. В кювету спектрофотометра вносят фосфатный буфер, раствор пирокатехина, резорцина и пероксидазы. Реакцию иницируют добавлением 0,03%-ного раствора перекиси водорода. После перемешивания реагентов определяют увеличение оптической плотности. Затем определяют активность фермента. с S