1
Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства бактерийных препаратов.
Известен способ получения вакцины против гепатита В путем выделения частиц HBsAg, содержащих е-антиген. на частицах или в растворе, из плазмы крови носителей антигена гепатита В, содержащей е-антиген с последующей инактивацией целевого продукта l . Однако вакцина, полученная . известным способом, не обладает высокой специфичностью.
Целью изобретения является повышение специфичности вакцины.
Эта цель достигается тем, что плазму кровиобрабатывают 3,04,5 вес.% полиэтиленгликоля при рН 4,4-4,7, полученный осадок, содержащий HBsAg частицы размером 30-50 нм, растворяют при рН 4,9-5,1, затем рН надосадочной жидкости доводят до 4,4-4,7, повторно обрабатывают полйэтиленгликолем и полученный осадок растворяют в физиологическом растворе.
Кроме того, целевой продукт инактивируют обработкой формалином или 1 -пропиолактоном или облучением рентгеновскими лучами.
Предлагаемым способом получают вакцину против вирусного гепатита, которая включает в свой состав антигенные частицы, имеющие размер частиц 20-50 нм, причем эти антигенные частицы содержат неосажденные свободные необъединенные гепатит р -поверхностные антигены. Вакцина имеет менее ДО единиц антител гепатит (Ь-поверхностного антигена на 1000 ед. гепатит |Ь-поверхностного антигена. 5% частиц и размером, лежащим в интервале 3-50 нм, содержат неосажденные е-антигены или специфичные антигены, аналогичные частицы Дана. Антиген гепатита и е-антиген содержатся в вакцине в количестве, достаточном для образования антител при введении их в организм животного.
Для получения, вакцины против гепатита В используют материал, состоясций из плазмы, полученной из хронического носителя, который содержит антигены. Такая плазма также содержит большое количество частиц Дана и волокон, не содержащих объединенного анти-е-антитела. Плазма может быть получена от клинически здоровых человеческих хронических носителей нВ, а также от шимпанзе, которых
естественно или искусственно инфицировали вирусом НВ и которые становились хроническими носителями е-антиген положительного HBsAg.
Исходный материал должен быть бактериологически стерильным и должен быть свободным от присутствия, адвентициальных вирусов.
Очистку проводят обычным способом
Из антигенсодержащего вещества крови удаляют примеси путем подкисления до рН 4,4-4,7. Выпавший осадок вместе с клеточными остатками удаляют центрифугированием в течение 20 мин со скоростью 10000 об/мин. После этого материал смешивают с 2,5-4,5 вес.% полиэтиленгликоля, предпочтительно с 3,0-4,5 вес.%. Более низкие концентрации, например 3:-4%, могут осаждать крупные фор1У1Ы ч;астиц и поэтому при определенных обстоятельствах являются предпочтительными. Весовой процент полиэтиленгликоля рассчитывают по. отношению к общему весу смеси. Таким образом, осаждают антигенный материал, содержащий гепатит В с более крупным размером частиц, например 30-50 нм, а также часть материала, содержащего оболочкоподобный гепатитный В поверхностный антиген. Осадок, содержа1дий HBsAg, регенерируют, и добавляют некоторое количество воды при рН 4,95,1. Образуется осадок, содержащий белковое вещество и полиэтиленгликоль, а жидкая фаза - надосадочная жидкость, содержащая HBsAg, содержит частицы Дана или волокнистое веществ рН недостаточной Жидкости доводят до 4,4-4,7. Затем ее смешивают с 3,0-4,5 вес.% полиэтиленгдиколя, считая на общий вес смеси, с образованием осадка, содержащего очищенные частицы, содержащие HBsAg поверхностный антиген, имеющие оболочкообразную конфигурацию с размером частиц 20-30 нм и волокнистые частицы, содержащие HBsAg и е-антиген, который не содержит какого-либо анти,-е-антитела, причем волокнистые частицы имеют диаметр 20-50 нм, а также частицы Дана со сферической конфигурацией, имеющие размер 40-50 нм и имеющие липопротеиновую внешнюю сферу, содержащую HBsAg и е-антигены, а также содержащие сердцевину, включающую ДНК, ДНК полимеразу и HBsAg.
В результате регенерируют очищенный антигенный материал. После этого его обрабатывают с целью инактивации вируса, а .полученный осадок растворяют в физиологическом растворе.
Температура каждой из смеси после каждой стадии смешивания поддерживают в интервале 0-80 С в ходе образован-ия осадков. Стадия очистки облегчается, если регенерацию усиливают врезультате центрифугирования с
последующими стадиями осаждения. Полиэтиленгликоль используют в виде водного раствора, который содержит 30 вес.% полизтиленгликоля. Такой Полиэтиленгликоль имеет мол. вес. 500-50000, предпочтительно около 60
Дальнейшую очистку осуществляют путем адсорбции очищенных антигенов на гидроксилаппатите с использованием хроматографии. Частично очищенные антигены пропускают через хроматографическую колднку, содержащую гидроксилапатит, на котором они адсорбируются. Дополнительно очищенные антигены затем регенерируют с использованием многоступенчатого элюирования. Частицы с размером 2550 нм регенерируются отдельно от фракций с частицами более мелкого размера (16-22 нм) и от основной масы сывороточных протеинов. После очистки фракция более крупных части может быть инфекционной. Для этого осуществляют инактивацию. Целевой продукт инактивируют обработкой формалином в концентрации 1:2000 в течение 4 дней при З7с с использованием обычных методик или облучением рентгеновскими лучами. Вакцину осветляют путем фильтрации через Millipore 0,22 /J фильтр или эквивалентный фильтр переддобавлением формалина или р -пропиолактона.
После инактивации конечный продукт подвергают диафильтрации с использованием Aroicon РПЗО фильтра или эквивалентного фильтра против 0,9% NaCI, содержащей 1:10000 Thiomerasal и любой стабилизатор, для удаления низкомолекулярных соединеНИИ, исп.ользуемЫх для инактивации, затем стерильно фильтруют и соответствующим образом разливают в стерильные ампулы для модификации или jзaмopaживaния. Вакцину используют на отсутствие инфекциозности, иммунологическую активность.
Вакцину можно применять путем подкожной или внутримышечной инъекции. Применяют обычно около двух до в месяц с последующим введением вспомогательного вещества в период от 6 мес. до 1 года после первичной иммунизации. Первоначальная дозировка зависит от веса организма, а последующие дозировки - в зависимости от уровня антител в крови после первоначальной иммунизации.
Использование получаемой вакцины против гепатита В предотвращает хроническое заболевание печени.
Пример 1. Очистка и определение НВ ассоциированных частиц из 7,8 л плазмы от одного шимпанзе-носителя HBsAq.
Вещества и методики. Источник HBsAg.
Антиген очищают из объединенной плазмы носителя шимпанзе, предварительно инокулированного человеческой HBsAg - положительной, плазмой, относящейся к adn подтипу. е-Антиген присутствует на поверхности способных к идентификации частиц Дана и используемой плазме.
Очистка HBsAg и е-антигена.
HBsAg и е-антиген выделяют из плазмы путем осаждения с помощью полиэтиленгликоля (PEG). Повторно суспендированный осадок HBsAg и е-антигена очищают хроматографированием на колонке с гидроксилапатитом. Конечные стадии очистки включает плотностное градиентное центрифугирование.
Осаждение HBsAg и е-антигена с помощью PEG.
На стадии, предшествующей очистке 7,800 МП HBsAg и на содержащей е-антигена плазмы, устанавливают рН 4,6 и добавляют 30%-ный раст.вор PEG в дистиллированной, воде до приблизительно 2% концентрации. Раствор оставляют на ночь при и осветляют центрифугированием HBsAg во всплышем слое, осаждают увеличением концентрации PEG до 4%. Всплывший слой после стояния в течение ночи при с декантируют и отбрасывают. Осадок HBsAg (содержащий е-антиген) ресуспендируют до 500 мл в дистиллированной воде. Основную часть PEG с некоторыми примесями осаждают, устанавливая рН раствора равным 5,0 и осадок удаляют центрифугированием. Прозрачный верхний слой доводят до рН 4,6 и HBsAg и ассоциированный с частицей. е-А HBsAg (е) осаждают в результате добавления 30% раствора PEG до конечной концентрации 4%. HBsAg/e удаляют центрифугированием после стояния образца в течение ночи при 4°С. Наконец, осадок HBsAg/e ресуспендируют до 320 мл в дистиллированной воде.
Хроматографирование на колонке с гидроксилапатитом.
50 мл ресуспендированного .PEG осадка HBsAg/e пропускают через колонку 6,5Х 16,5 с гидроксилапатитом и элюируют прерывистым градиентом фосфатного буфера. В следующем эксперименте 200 мл образца под.вергают частичной очистке на колонке 6,5х 35 см с гидроксилапатитом. HBsAg, элюированный совместно с первым протеиновым пиком, пропускают через колонку с гидроксилапатитом во второй раз.
Плотностное градиентное центрифугирование.
Фракции HBsAg, выделенные хроматографированием на колонке, очищают скоростным зональным центрифугированием. Прерывистый градиент получают при использовании 3 мл 60% и 7 мл 40% сахарозы в 0,02 М натрийфосфатном буфере при рН 7,2 (содержащем 0,02% NaH) .
В каждую пробирку загружают по 20 мл образца и центрируют на Spinso SW 25,1 роторе при 18000 об/мин в течение 18 ч.Фракции объемом l мл собирают по каплям со дна пробирок и анализируют на содержание HBsAg.
O Фракции, содержащие максимальное количество антигенной активности, объединяют, тщательно диализируют и концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны с 30000 MW
s от жимным рантом (Амикон РМ-30) .- Концентрированные фракции HBsAg подвергают конечным стадиям очистки изопикническим связыванием в линейном градиенте CsCI и скоростному зональ0ному центрифугированию в прерывистом градиенте сахарозы при обычно используемых условиях.
Методы детектирования.
За содержанием HBsAg следят ме5тодом встречного электрофореза (СЕР) или твердо-фазной радиоиммунопробой Ausria 1 или II, Abbott Laboratories. Концентрацию протеина устанавливают при 280 нм сиспользованием микроме- тодики Kjehldahl.
0
Критерий чистоты HBsAg.
Образцы после каждой стадии очистки анализируют методами целлюлозоацетатного электрофореза, иммуноэлектрофореза и испытаниями диффузии
5 в системе агарового геля по отношению к поливалентной антинормальной человеческой плазмапротеиновой антисыворотке.
Полиакриламидный гелевый элект6рофорез.
Аликвоты образцов, содержащие 0,01 натрий фосфатный буфер прирН,2, 1% натрий додецилсульфата, 1% 5-меркаптоэтанола и 10% глицерина, нагревают в течение 2 мин на кипящей водяной бане, обрабатывают 7,510%i найтрийдодецилсульфатакриламидными гелями.
Результаты очистки HBsAg/e поло0жительных сывороток осаждением с помощью полиэтиленгликоля представлены в таблице. Около 87% первоначального протеина плазмы удаляются на первой стадии осаждения HBsAg (которая включает предочистку при концентрации
5 PEG 2%). Конечный выход после двух последовательных стадий осаждения с помощью PEG jipKa3HBaeT количественную регенерацию HBsAg в присутствии лишь 4% первоначальных протеинов.
Q
Очистка объединенного HBsAg шимпанзе осаждением с помощью PEG-6000. Первоначальная HBsAg-плазма 7,800 512 Первое осаждение 4% PEG Второе осаждение 10,QQO 4% PEG
50 мл ресуспендированного PEG осадка HBsAg фракционируют хроматографированием на гидроксилапатите. Элюат группируют на семь фракций, которые диализируют по сравнению с 0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азиданатрия) и концентрируют ультрафиль/грацией. Концентрированные образцы авализирутот на. протеины при 280 нм и на присутствие HBsAg методом СЕР.
200 мл ресуспендированного PEG осадка HBsAg фракционируют на 1000 колонке с гидроксилапатитом. Фракции HBsAg из первого протеинового пика (группа 1: фракции 38-83) и оставшийся элюат (группа 11: фракци 84-110) объединяют и концентрируют до 75 мл ультрафильтрацией.
Концентрированный образец из группы 1 повторно хроматографируют на колонК объемом 1000 мл с гидроксилапатитом.
Элюат объединяют на росемь фракций. Объединенные образцы концентрируют ультрафильтрацией и промывают 0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азида натрия) . Эти образцы анализируют на протеин и HBsAG.
Анализ образцов на содержание прмесей методом иммуноэлектрофореза обнаружил очень слабую линию преципитации во фракции I, более сильную линию во фракции ti-Vi и сильно вырс1женную широкую линию в объединенных фракциях Vlf-VIII , которые мигрируют между альфа2 и альбуминной областями .
Электронная микроскопия образцов обнаружила в основном сферические частицы с диаметром 22-28 нм во фракциях 1-ш , сферические частиць и волокна, во фракциях W -Vl , главны образом небольшие сферические частицы и некоторое количество волокон .во фракциях ill М wКонцентрированные образцы из пре)зыдущих стадий подвергали полной очистке плотностным градиентным ценрифугированием.
Очищенные препараты HBsAg, состоящие главным образом из сферических частиц диаметром 20-22 нм, сферических частиц диаметром 22-28 м. 429 7,080
волокон, различного размера и частиц Дана, содержащих по 100 мг протеина, анализируют на полипептидный состав полиакриламид гелевым электрофорезом. Количественную разницу наблюдают в Протеиновых пиках индивидуальных образцов.
Пики карбогидратов низкого молекулярного веса представляют собой гликолипйды, поскольку они не проявляются при голубом окрашивании по Coomassie.
Вакцину готовят из фракций крупных частиц, полученных в результате добавления человеческого сывороточного альбумина с концентрацией 0,5 мг/мл с последующей инактивацией по сериям облучением от кобальтового источника (2,5 миллиона ращ) инактивацией формалином с использованием общепринятых методик ( , 96 ч, концентрация 1:2,000), с последующим использованием р-пропиолактона по методикам, обычно используемым при производстве вакцин против бешенства.
Пример 2. Модифицированная .усовершенствованная PEG методика для выделения HBsAg/e.
Модифицированную методику для осаждения PEG используют на 2,6 л смешанной HBsAg, содержащей плазмы от одного шимпанзе-носителя, содержащего е-антиген в необъединенном, неосажденном виде. рН плазмы устанавливают равным приблизительно 4,6 и немедленно добавляют 30%-кый раствор PEG до конечной концентрации 2%. Раствор вымораживают на льду в течение 30 мин (вместо стояния в течение ночи при 4°С, как в предыдущем примере) и осадок удаляют центрифугированием.
Во Ъсплывшем слое, содержащем HBsAg, устанавливают концентрацию PEG, равную 4% (вместо 4,5% в предыдущем примере) в результате добавления 6,6 ч на 100 30%-ного раствора PEG при комнатной температуре, Сус0 пенэию снова вымораживают на льду в течение 30 мин и осажденный HBsAg/e удаляют центрифугированием. Осадок ресуспендируют до 200 мл в дистиллированной воде. Основную часть 5 PEG и сопутствующих примесей удаляют 00
путем установления рЫ, равным 5,0, вымораживанием раствора на льду в течение 30 MiK и удалением полученного в результате осадка центрифугированием. рН прозрачного всплывшего слоя из предыдущей стадии вновь устанавливают равным 4,6 и добавляют 30% PEG до конечной концентрации порядка 3% (вместо 4,0-4,5%, как это делали ранее). Вещество вновь выморакивают на льду в течение 30 мин и осадок HBsAg/e удаляют центрифугированием.
Осадок из предыдущей стадии,- содержа ций HBsAg/e, суспендируют в 10 мл дистиллированной воды. Основную массу PEG осаждают в результате устаьовления рН равным 5,0. После стояния в течение ночи при 4С суспензию осветляют центрифугированием. Прозрачный верхний слой, содержашд й HBsAg/e, дополняют 0,5 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 до конечной концентрации порядка 0,02 М и устанавливают конечный объем, равный 120 мл. с помощью дистиллированной воды.
Результаты такой очистки показывают более чем 33-кратную очистку HBsA
Пример 3. Фракционирование HBsAg/e периодической обработкой гидроксилапатитом.
Ресуспендированный PEG осадок HBsAg/e (пример 2) обрабатывают периодически гидроксилапатитом вместо процесса хроматографирования на колонке, .500 мл объем насадочного гидроксилапатита (Bio-Rad-Labs) суспендиру:.т в 800 мл 0,02 М натрий-фос фатном буфере при рН 7,2 и после добавления препарата HBsAg/e перемешивают магнитной мешалкой в течение 30 мин при комнатной температуре. Шлам делят на две равные аликвоты и центрифугируют в чашах емкостью 1 л на центрифуге Sorvall RC-3 со скоростью 4,000 в течение 10 мин. Верхний слой декантируют и осадок последовательно промывают порциями в 1 л с 0,02 М и 0,05% ,на|Трий-фосфатного буфера при рН 7,2, Элюаты объединяют, концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны РМ-ЗО и диафильтруют 0,02 М фосфатным буфером с рИ 7,2, 0,02% МаН-з и доводят до объема 60 мл тем е буфером.
Концентрированный образец далее очищгиот скоростным зональным центрифугированием в прерывном градиенте сахарозы.
Отделенные частицы HBsAcj/e разделяют на три фракции, диалиэируют и концентрируют ультрафильтрацией, Образцы,- исследованные методом электронной Г/икроскопии, обнаружили главным образом крупные волокна и частицы Дана во фракции 1; волокна, частицы Дана и сферические частицы дйс1метром 22-28 нм во фракции и и сферические частицы ДJ aмeтpoм 20-28 нм во фракции 1.
Пример 4 .-; Дисаггрегация HBsAg/e частиц с помощью ионных и неионных детергентов.
HBsAg/e дастицы обрабатывают при комнатной температуре (в течение 5 1чмн - 2 ч) следующими детергентами: 0,5-2% Nohidett NP (детергент) (Shell Oil Co.), 0,5-2% Твина 80
0 (поверхностно-активный агент), 5-10% Тритона Х-100 (органический поверхностно-активный агент), 0,1-1,0% додецилсульфата натрия и т.д. Целью обработки является усиление антиген5ной активности в образцах, обработанных детергентом, и инактивация инфекциозности этих образцов.
Оптимальные условия обработки определяют путем анализа образцов
0 перед и после обработки детергентом с использованием тонкослойной и изоэлектрической фокусировки. Индивидуальные компоненты дисаггрегированных образцов могут быть выделены с использованием различных методик
5 разделения, например молекулярным исключением, адсорбцией, способами ионообменного хроматографического ультрацентрифугирования, различнымк методами электрофореза и т.д.
0 Одним из наиболее высокоэффективных способов является метод зонного конвекционного изоэлектрического фокусирования, описанный ниже.
Изоэлектрическое фокусирование.
5
Тонкие слои получают на Sephadex75 гель целлюлозного носителя в 1%ном растворе амфолина при рН 4,0-6,0 или рН 3f5-10,0. Пластины помещают в м льтипоровое устройство. Отпечатки делают на хроматографической -бумаге. Отпечатки разделяют вдоль линии отделенных образцов и разрезают ка зоны 0,5-1 см. Индивидуальные зоны далее разрезают на более мелкие части, смачивают 0,2 мл буферного солевого раствора и элюируют 0,2 мл нормальной (не содержащей HBsAg и анти-КВ) человеческой сыворотки. Ллилсвоты в 200 мл из каждого элюата используют для радиоиммуноанализа. Полоски между разделенными образцамг: также разрезают, элюируют 0,4 мл дегазированной дистиллированной воды и используют для измерения рН. Если берут два отпечатка, то первый ис5пользуют для окрашивания на протеин а второй разрезают для радиоиммуноанализа на HBsAg и измерений рН. АЛИквоту из каждого образца обрабатывают 5-10% неионного детергента
) (Тритон ) в течение 20 мин при комнатной температуре перед контактированием с гелем и выдерживают при описанных выше условиях при сравнении с образцом, который еще не обра5батывали детергентами.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В (HBS AG), МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА СВ-HEPI, ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА В (HBS AG) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО КЛОНА 48/1/574, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА СВ-HEPI | 1992 |
|
RU2128707C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННЫХ ЧАСТИЦ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В, ОЧИЩЕННАЯ ЧАСТИЦА ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В ЧЕЛОВЕКА И ВАКЦИНА ПРОТИВ ГЕПАТИТА В | 1990 |
|
RU2080876C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ HANSENULA POLYMORPHA И ВАКЦИНА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В | 2002 |
|
RU2205023C1 |
Способ получения гибридного полипептида, содержащего НВ @ А @ | 1988 |
|
SU1746887A3 |
Способ получения препарата инактивированного поверхностного антигена гепатита @ для активной иммунизации | 1982 |
|
SU1175489A1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ИЗ ФРАКЦИЙ, КОТОРЫЕ ОБРАЗУЮТСЯ ПРИ ФРАКЦИОНИРОВАНИИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ПЛАЗМЫ КРОВИ | 1996 |
|
RU2157240C2 |
СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА B, СОДЕРЖАЩЕГО ПРЕ S2 ПЕПТИД, ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ, ВАКЦИНА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГЕПАТИТА B | 1995 |
|
RU2122430C1 |
Способ получения антигена вируса Зика, обладающего иммуногенными и антигенными свойствами | 2019 |
|
RU2717993C1 |
ПОЛИЭПИТОПНАЯ ВАКЦИНА 4-ГО ПОКОЛЕНИЯ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | 2011 |
|
RU2469741C1 |
Способ получения поверхностного антигена гепатита В из плазмы крови человека | 1982 |
|
SU1409121A3 |
Авторы
Даты
1980-04-15—Публикация
1976-03-12—Подача