Способ подготовки к исследованию инвазионного материала Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии, в частности к медицине и ветеринарии и может быть использовано для устаноления антихолинэстерального механизма действия антигельминтик ов и целенаправленного отбора средств, парализующих функции нервно-мышечного аппарата гельминтов.

- Цель изобретения - упрощение и ускорение способа исследования за счет сокращения количества стадий.

Способ осуществляют следующим образом.

Материалом для исследования слу-. жат подвижные половозрелые гельминты, которых сразу же после извлечения -промывают в теплом (ЗУ С) физрастворе, фиксируют в течение 24 ч в 10%-ном. растворе формалина, при- готовленном на физрастворе. После фиксации промывают 6 ч в физрастворе с частой его сменой (каждые 10 мин Перед помещением в инкубационную среду фасциол споласкивают дистиллированной водой.

Инкубационную среду готовят перёд употреблением, используя заранее заготовленные навески, которые могут продолжительно храниться. На 1 nonoвозрелый организм расходуют 1 порцию инкубационной среды, в которую его помещают целиком (без изготовления с резов) . Для получения I порции (5,45 мл) инкубационной среды с рН 5,6-5,8 сначала готовят 1,6 мл буфера, растворяют заранее заготовленные навески (135 мг ацетата натрия в 1,5 мл дистиллированной воды) и добавляют 0,15 мл раствора уксусной кислоты,приготовленной тут же путем разведения 0,03 мл ледяной уксусной кислоты в 1 мл дистиллированной во- ды. Из остальных навесок ингредиентов среды также готовят растворы из. расчета на 1 мл дистиллированной воды: 20 мг ацетата меди, 19 мл гликр- .кола, 7 мг ацетилтиохолина (АТХ). Далее в стаканчик с 1,6 мл буфера добавляют 0,1 мл раствора ацетата меди, 0,2 мл раствора гликокола, фильтрованный раствор субстрата и 2,5 мл дистиллированной воды. Для получения фильтрованного раствора субстрата к 1 мл растворенного АТХ добавляют 0,13 мл раствора ацетата меди и спустя 3 мин фильтруют его через смочен ный водой фильтр. Инкубацию проводят 24 ч при комнатной температуре.

5 0 5

Q ,« 55

5

45

Для оценки активности холинэстера-. зы в различных тканевых структурах необходима обработка фасциол 1%-ным раствором сульфида натрия, благодаря чему белого цвета осадки конечного, продукта реакции - тиохолина меди - в местах нахождения холинэсте- разы окрашиваются от светло-коричневого (слабая активность) до черного цвета (высокая активность).

После многократной промьйки в дистиллированной воде (в течение 20 мин) фасциол, обработанныйЧ%-ным раствором сульфида натрия (или необработанный им) фиксируют 18 ч в 20%-ном растворе формалина, снова промьшают 20 мин в воде и помещают для просветления и хранения в 75%-ный водный раствор глицерина, который легко отмывается водой, не влияя отрицательно на последующий этап обработки сульфидом натрия в случае хранения не проявленных (не обработанных им ранее) фасциол.

Пример.. Материалом для :Ис- следования служат подвижные половозрелые печеночные сосальщики Dicro- coelium lanceatum, которых сразу же после извлечения из печени промьша-- ют в теплом (37 С.) физрастворе, фиксируют в течение 24 ч в 10%-ном растворе, формалина, приготовленном на физрастворе. После фиксации дикроце- лиев промьгоают 3 ч в физрастворе с частой его сменой (каждые 20 мин). Перед помещением в инкубационную среду дикроцелиев споласкивают дистиллированной водой.

Инкубационную среду готовят т ак- де как в примере 1. На 10 половозрелых дикроцелиев расходуют I порцию инкубационной среды, в которую их помещают целиком (без изготовления срезов). Инкубацию проводят 24 ч при комнатной температуре.

Для оценки активности холинэсте- разы в различных тканевых структурах необходима обработка дикроцелиев 1%-ным раствором сульфида натрия, благодаря чему белого цвета тиохолина меди в местах нахождения холинзстеразы окрашиваются от светло-коричневого (слабая активность) до черного цвета (высокая активность)

После иногократной промывки в дистиллированной воде (в течение 20 мин) дикроцелиев, обработанных 1%-ным раствором сульфида натрия (или необработанных им), фиксируют 6 ч в 20%- ном растворе формалина, снова промывают 20 мин в воде, и помещают для просветления и хранения в 75%-ный водный раствор глицерина, который легко отмьшается водой, не влияя отрицательно на последующий этап обработки сульфидом натрия в случае хранения не обработанных им ранее непроявленных дикроцелиев.

П р и м е р 2. Материалом для исследования служат половозрелые фас- циолы, извлеченные из печени двух экспериментально зараженных овец литовской черноголовой породы, одной из которых через рот был введен однократно ацемидофен в дозе 150 мг/кг а другая служила нелеченным котролем Обе овцы были убиты спустя 28 ч после дегельминтизации первой из них. Фасциол, извлеченный из печени, про- мьтают в теплом ) физрастворе и фиксируют 24 ч в 10%-ном растворе формалина на физрастворе, затем про- мьшают их в физрастворе в течение

6ч, сменяя его каждые 10 мин. Перед )гтомещением в инкубационную среду фасциол ополаскивают дистиллированной водой. Приготовление

.инкубационной среды, а также процесс проведения гистохимической реакции такие же, как в примере 1.

Об антихолинэстеразном действии ацемидофена на нервно-мышечный аппарат фасциол судят по разнице в интенсивности окраски ферментосодержащих структур у интактных и подвергшихся действию ацемидофена трематод.. Устанавливают, что ацемидофен избирательно действует на ротовой аппарат 0 фасциол, угнетая холинэстеразу в тканях ротовой присоски и полностью ингибируя ее в тканях глотки. В связи с ЭТШ- не только нарушаются пищеварительная и эвакуаторная функ5 ции, но фасциолы утрачивают способность прикрепляться к тканям хозяина и вымьгоаются из печени током желчи еще живыми, но парализованными.

0 Формула изобр-е тения

i

Способ подготовки к исследованию инвазионного материала путем взятка 5 биообъекта, фиксации, промывки, при- готовления серийных срезов, окрашива- Ция с применением сернистого натрия, отличающийся тем, что, с - целью упрощения и ускорения способа Q за счет сокращения количества стадий, промьшку ведут 3-6 ч,.а окрашивание ; проводят при комнатной температуре в цельном биообъекте.

Изобретение относится к биологии, касается медицины и ветеринарии, пред- назназеноЗ для установления антихолинэстерального механизма действия антигельминтиков и целенаправленного отбора средств, парализующих функ г ции нервно-мьппечного аппарата гелв- минтов. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа исследования за счет сокращения количества стадий. Для этого половозрелые гелвминты про- мьшают в теплом () физрастворе м фиксируют 24 ч в 10%-ном растворе формалина, приготовленном на физрастворе. После фиксации промывают в физ растворе с частой сменой его .(каждые 10 мин). Перед помещением в Ьикуба-- ционную среду фасциол споласкивают дистиллированной водой. Инкубацию проводят 24 ч при 18-22 0. Q « (Л