Способ приготовления субстратно-инкубационной смеси для выявления изоферментов холинэстеразы Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

У Изобретение относится к медицинской химии, а именно к способам выявления изоферментоБ холинэстеразы (КФ 3.1.1.8), и может быть использовано в медицине, токсикологии, генетике, молекулярной биологии и гистохимии. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ приготовления субстратно-инкубационной смеси для выявления изоферментов холинэстеразы, предложенный А.П.БресткиныМусогласно которому субстратно-инкубационная смесь готовится в указанной последовательности: к 0,2 мл 2,5%-ного раст вора сульфата меди добавляют 0,2 мл 3,75%-ного раствора хлорида магния и 10,0 мл 0,2м раствора малеатного буфера с.рН 7,3, последним добавляется раствор субстрата - ацетилтиохолиниодида или бутирилтиохолиниодида. Раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием следующим образом : 15 мг ацетилтиохолинйодида или 16,5 мг бутирилтиохолинйодида в виде порошка растворяют в 0,75 мл дистиллированной воды, добавляют 0,3 мл 2,5%-ного раствора сульфата меди и образовавшийся осадок йодида одновалентной меди отделя ют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин , а затем раствор субстрата в виде надосадочно жидкости добавляют к предыдущим компонентам смеси. Выявление изоферментов холинэстеразы происходит при инкубации гелей после электрофореза субстратно-инкубационной смеси указанного состава в течение 20 мин при ЗОс путем осаждения образовавшегося в ходе ферментативной реакции гидролиза тиохолина ионами двухвалентной меди с последующей денситометрией гелей и количественной оценкой выявленных зон l . Недостатком известного способа является необходимость, как отдельно стадии, приготовления раствора субст рата -ацетилтиохолиниодида или бути рилтиохопиниодида для выведения из процесса ионов йода путем осаждения его в виде осадка йодида одновалентной меди, что влечет за собой необходимость использования оборудования (центрифуги), затраты электроэнергии и увеличение времени приготовления субстратно-инкубационной смеси. Если {юны йода не удалить из раствора субстрата, то при последующем смешивании его с приготовленной смесью предыдущих компонентов произойдет образование осадка йодида одновалентной меди в субстратно-инкубационной смеси, в результате чего она станет непригодной для выявления изоферментов холинэстеразы. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа приготовления субстратно-инкубационной смеси для выявления изоферментов холинэстеразы с сохранением качества выявления путем изменения последовательности добавления компонентов при приготовлении смеси. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготовления субстратно-инкубационной смеси для выявления изоферментов холинэстеразы, включающему смешивание 2,5%-ного раствора сульфата меди с 3,75%-ным раствором хлорида магния и добавление 0,2 М раствора малеатного буфера с рН 7,3 и раствора ацетилтиохолиниодида или бутирилтиохолиниодида, порошкообразный ацетилтиохолиниодид или бутирилтиохолиниодид растворяют в буферном растворе, а к нему последовательно добавляют раствор хлорида магния и сульфата меди. Растворение.порошка субстрата в малеатном буфере создает субстратнобуферную среду, в которой комплексные растворимые соединения препятствуют образованию осадка.йодида одновалентной меди. Способ осуществляют следующим образом. 15 мг ацетилтиохолиниодида и 16,5 мг бутирилтиохолиниодида в виде порощка растворяют в 10,0мл 0,2 М раствора малеатного буфера с рН 7,3, потом добавляют 0,2 мл 3,75%-ного раствора хлорида магния, последним добавляют 0,5 мл 2,5%-ного раствора сульфата меди. Пример 1. (Расчет дан для проведения одного анализа, т.е. для инкубации одного гелевого столбика). По предлагаемому способу субстратноинкубационную смесь для выявления изоферментов холинэстеразы в гелях готовят следующим образом. Смешивают 50,0 мл 0,2 М раствора однозамещенного малеата натрия с 50,0 мл 0,2 М раствора едкого натра и доводят до объема 200,0 мл дистиллированной водой, получая 0,2 М раст вор малеатного буфера с, рН 7,3. Затем 15 мг (5,) порошка ацетилтиохолиниодида растворяют в 10,0 мл 0,2 М раствора малеатного буфера с рН 7,3, а потом добавляют 0,2 мл 3,75%-ного раствора (7,9 .10 М)хлорида магния, последним добавляют 0,5 мл 2,5%-ного раствора (7,840 М) сульфата меди. Субстрат но-инкубационную смесь тщательно переметив ают. Для выявления изоферментов сывороточной холинэстеразы после проведения диск-электрофореза в 7,5%-ном полиакриламидном геле с использованием Трис -глицинового электродного буфера рН 8,3 гели преинкубируют в 0,2 М растворе малеатного буфера 30 мин при 30°С. Затем гели помещают в субстратно-инкубационную смесь, приготовленную указанным способом и инкубируют 20 мин при 30 С. Выявленные зоны холинэстеразной активности в виде белых полос тиохолината двухвалентной меди денситометрируют в проходящем свете с последующей количественной оценкой полученных пиков кривой на денситограмме. Пример 2. Смешивают 50,0 мл 0,2 М раствора однозамещенного малеата натрия с 50,0 мл 0,2 М раствора едкого натра и доводят до объема 200,0 мл дистиллированной водой, получая 0,2 М раствор малеатного буфера с рН 7,3. 16,5 мг (7,4-10 М порошка бутирилтиохолиниодида раство ряют в 10,0 мл О ,2 М раствора малеа ного буфера с рН 7,3, затем добавляю 0,2 мл 3,75%-ного раствора (7,) хлорида магния. Последним добавляют 0,5 мл 2,5%-ного раствора (7, сульфата меди. Полученную субстратноинкубационную смесь тщательно перемешивают. Последующие операции по выявлению изоферментов холинэстеразы производят описанным образом. В результате применения предлагаемого способа по сравнению с прототипом упрощается и ускоряется процесс приготовления субстратно-инкубационной смеси дли выявления изоферментов холинэстеразы, так как устраняется операция по приготовлению раствора субстрата и центрифугирование осадка, устраняется необходимость эксплуатации лабораторного оборудования (центрифуги лаборатор|ной), экономится электроэнергия, которая затрачивается в прототипе на операцию центрифугирования (100 НА/ /ч при использовании лабораторной . клинической центрифуги ОПн-3 в ходе приготовления субстратно-инкубационной смеси для одного анализа). Кроме того, за счет ликвидации операции по приготовлению раствора субстрата по прототипу с центрифугированием сокращается время, затрачиваемое на приготовление субстратно-инкубационной смеси (минимум на 30 мин при проведении одного анализа). Осадок, полученный в процессе центрифугировакия, с большими трудностями удаляется из пробирок дпя центрифугирования, что не дает возможности для повторного их использования и требует дополнительного расхода лабораторной посуды. Качество выявленных изоферментов сывороточной холинэстеразы по предлагаемому способу не уступает качеству выявленных изоферментов по прототипу .

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУБСТРАТНО-ИНКУБА1ЩОННОЙ СМЕСИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИЗОФЕРМЕНТОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ, включающий смешивание 2,5%-ного раствора сульфата меди с 3, 75%-ным раствором хлорида магния и добавление 0,2 М раствора малеатного буфера с рН 7,3 и раствора ацетидтиохолиниодида или бутирилтиохолиниодида, отличающийся тем, что, с целью упрощения .и ускорения способа, порошкообразный ацетилтиохолиниодид или бутирилтиохолиниодид растворяют в буферном растворе, а к нему последовательно добавляют раствор хлорида магния и сульфата меди.