Способ получения изоцитратдегидрогеназы Советский патент 1988 года по МПК C12N9/04 C12N9/04 C12R1/40 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения изоцит- ратдегидрогеназы, которая находит применение в клинико-химической диаг- г ностике и в анализе продуктов питания для количественного определения изо- цитрата.

Известен способ получения изодит ратдёгидрогеназы из Escherichia coli,io предусматривающий культивирование продуцента на питательной среде с последующими вьщелением и многостадийной хроматографической очисткой целевого продукта. На иммобилизованном tS текстильном красителе Cibacron Blue F3G-A. Активность целевого продукта до 1,2 ИЕ/мг белка(Ма8§ис2 В, Reeves Н.С. Biochem Biophys. Acta, . ; V. 578, p. 31-40, 1979).20

Недостатки известного способа - многостадийность хроматографической очистки и использование патогенного продуцента.

Цель изобретения - удешевление проЧ5 цесса,

.Поставленная цель достигается использованием.в качестве продуцента штамма Pseudomonas putida АТСС 17633, ранее известного как продуцент 3-гид- зо роксибутиратдегидрогеназы (хозяйственньй патент ГДР № 149874, кл. С 12 N. 9/04, 1980).

Культивирование штамма осуществляют преимущественно на 2%-ном ага- , ре при 4 С в темноте и использовании

в качестве источника углерода декана и сульфата аммония в качестве

источника азота.

Культивирование Pseudomonas putidaдд

АТСС 17633 осуществляют после заралсе- ния посевной культурой при температуре 20-40°С (преимущественно при 30°С) в субмерсионной. культуре на жидкой минимальной среде.

Выращивание проводят в условиях такого газового состава воздуха, при .котором образование изоцитратдегид- рогеназы не подавляется избытком внутриклеточного НДЦН. Так как это характерно как в случае начального роста, так и при достижении стационарной

. фазы, активность фермента показывает острый максимум, который достигается в конце логарифмической фазы роста. Такое развитие имеет место при приме- нении всех источников углерода, которые штамм в состоянии использовать, Абсолютные значения, которые могут

50

5

0

быть достигнуты в максиьг/ме для активности фермента, находятся в зависимости как от газовых условий, так - и от источника углерода. Особенно приемлемыми такие вещества, у которых в процессе окисления возникает большое число таких промежуточных продуктов, как ацетоацетат, которые при ограниченном снабжении кислородом в их дальнейших реакциях потребляют НАДИ и тем самым регенерируют НАД . Пример таких веществ представлен в табл. 1.

Культивирование проводят на косом агаре, причем источники углерода добавляют в концентрации по 0,5% каж- дьй. После инкубации 24 ч при 30° С бактерии смывают. Активность определяют после замораживания-оттаивания клеток в присутствии 0,1% тритона X 100.

Специфическая активность изоцит- ратдегидрогеназы в грубом экстракте из Pseudomonas putida АТСС 17633 по-, еле роста на различных источниках углерода приведена в табл. 1. ....

В качестве источников азота используют , (N114)7.504 и т.п. По истечении времени роста 5-40 ч в зависимости от физиологического состояния и количества заражаемого материала бактерии собирают центрифугированием,, промывают фосфатным буфером с получением бесклеточного экстракта.

Содержащийся в бесклеточном гру- бом экстракте фермент показывает в зависимости от источника углерода представленные .в табл. 1 специфические активности:. Речь идет при этом об эмерсионном культивировании на 2%-ном .агаре. При субмерсионных условиях культивирования такие значения . активности достигаютсяпосле соответствующего оптимирования газового состава и скорости перемеимвания в зависимости от конструкгщонных параметров ферментационного сосуда. Особенно хорошие результаты достигались тoгдaj когда культивирование проводилось при применении углеводородов в качестве источников углерода, которые подводились к ферментацнонно сосуду в газообразном состоянии. Из бесклеточного грубого белкового экстракта изоцитратдегидрогеназу выделяют фракционированным осаждением солями или экстракцией сульфатом г 1мония 531418338

этого к rpy6ohry белковому

10 раз. Для экстракту добавляется твердый сульфат аммония до конечной концентращги в 70% насьпцения,, причем вся активность переходит в осадок. Для дальнейшего обогашения изоцитратдегидрогеназы остаток перемеилшается каждые 5 мин с раствором сульфата аммония, содержащего 0,05 моль/л NaH2P04 при О С и снижающихся концентрациях сульфата аммония. Фермент растворяется при этом в возрастающей степени. Основное количество растворяется при этом в промежутке концентраций сульфата аммония между 40 и 50% насыщения. Фермент снова осаждают добавлением сульфата аммония до конечной концентрации в 70%.

материала

10

15

0505, При . ЛЬТИВИровании на углеводородах, например на гекг.ане, источник углерода подают через газовую среду. Б 10-литровом ферментативном сосуде с наполнением до 7 л поступление газовой смеси (2- 10 л/ч) осуществляют через содержащую гексан промывную склянку при 30С Среднее поступление гексана в фермен таци онньпЧ сосуд при этих условиях составляет около 5-10 мп/ч. Культу- р.альная среда интенсивно перемегаи- вается (800 об/мин) .. После культивирования в гечение 25 ч при 30°С мутность среды составляет после этого Е.„„ , оактерии собирают

посредством центрифугирования, промывают фосфатным буфером 0,05 м/л

Предлагаемьш фермент хорошо сохра-2о разрушают с помощью ультразвука при . Бесклеточньй грубьм экстракт получают центрифуггфованием Специфическая активность изоцитратдегидрогеназы FipH этих условиях достиняется. При специфической активности 5-10 ммоль/мин/мг белка установлено не более следующих чужеродных активностей: алкоголь-, манат- и лактатматериала

0505, При . ЛЬТИВИровании на углеводородах, например на гекг.ане, источник углерода подают через газовую среду. Б 10-литровом ферментативном сосуде с наполнением до 7 л поступление газовой смеси (2- 10 л/ч) осуществляют через содержащую гексан промывную склянку при 30С. Среднее поступление гексана в фермен- таци онньпЧ сосуд при этих условиях составляет около 5-10 мп/ч. Культу- р.альная среда интенсивно перемегаи- вается (800 об/мин) .. После культивирования в гечение 25 ч при 30°С мутность среды составляет после этого Е.„„ , оактерии собирают

посредством центрифугирования, промывают фосфатным буфером 0,05 м/л

разрушают с помощью ультразвука при . Бесклеточньй грубьм экстракт получают центрифуггфованием. Специфическая активность изоцитратдегидрогеназы FipH этих условиях дости

Изобретение относится к биотехнологии. С целью удешевления процес-- са осуществляют культивирование продуцента штамма Pseudomonas putida АТСС 17633 на питательной среде до максимальной активности, отделение клетО;:, получение бесклеточного экстракта, фракционирование сульфатом аммония до 40-50% насьщения, Хромйто- графическую очистку полученного экстракта ведут на 10-карбоксидецилсефа- розе. Способ предусматривает использование в качестве источника углерода веществ, у которых в процессе окисления образуются ацетоацетаты, которые при регулируемом снабжении кислородом потребляют НАДН и тем самым , регенерируют НАД . Активность фермента в грубом экстракте 1-3 ИЕ/мг, пос- с ле очистки достигает 50 ИЕ/мг 1 з.п. ф-лы, 2 табл. (Л

дегидрогеназы, каждая менее. 1%, Изо- 25 Г ает значений 2 ПЕ/мг. Этот белковьй

грубый экстракт разводят 0,05 м/л фос фатным буфером рН 8 до достижения содержания белка 20 мг/мл. Из этого раствора при 4°С путем добавления сульфата аммония до конечной концепт- рации в 70% насыщения осаждают основную часть белка.

цитратдегидрогеназа при применении гидрофобной хроматографии на 10-кар- боксидеиилсефарозе может быть обогащена до спе;дифической активности в 50 ИЕ/мг.

Пример. Культивирование Pseu- domonas putida А.ТСС 17633 проводят в среде, содержащей на 1 л следующ1- е ингредиенты: KjHPO 7,46 г/л; 0,54 г/л; MgSO.f 7Н,0 20 мг; 20 мг; РеСМН) i(S04)i-6Н2 0 10 мг.

В качестве источника азота служит (NH4)iS04 - 1 г/л.

Для эмерсионн.ого культивирования штамма в пробирка с косым 2%-ным агаром (Дифко-агар) агар гютовят на основе описанной среды, В проби жу вносят 6 №1 раствора агара. Затвердева- агара .осуществляют в максимально возможном горизонтальном положении пробирок. Для поддержания штамма пробирки .после пересева на поверхность с помощью петли ставят вертикально. Затем добавляют 0,1 мл декана, причем поверхность геля только в основании сосуда пр11ходит в соприкосновение с источником углерода.

После инкубации при в течение приблизительно 60 ч бактерии смывают с поверхности агара 2 мл 0,05 К фосфатного буфера рН 7,5 (Е ,5) и применяют дпя заражения субмерсион- иой культуры,- Плотность посевного

5 Г ает значений 2 ПЕ/мг. Этот белковьй

0

5

0

5

0

грубый экстракт разводят 0,05 м/л фос фатным буфером рН 8 до достижения содержания белка 20 мг/мл. Из этого раствора при 4°С путем добавления сульфата аммония до конечной концепт- рации в 70% насыщения осаждают основную часть белка.

Общая активность изоцитратдегидрогеназы находится в осадке. После . центрифугирования осадок суспендируют при 0°С в растворе сульфата аммония (40% насытцения) в 0,05 М NaHPOj, и центрифугируют. После повторения процедуры свыша 80% общей активности изоцитратдегидрогеназы находится в супернатанте (табл. 2),

Результаты обогащения изоцитратдегидрогеназы из Pseudomonas putida посредством экстракции сульфатом аммония, приведены в табл. 2.

Фермент снова осаждают путем до- бавления сл льфата аммония до конечной концентрации в 70% насьш;ения. Полученный посредством экстракщш с,- сульфата аммония супернатант .(супер;- натант 2) в количестве 15 мл с содержанием белка в 130 мг наносят на колонку, содержапо ю 80 m 10-кар- боксидецилсефарозы и элюгфуют при 22 С 200 мл раствора сульфата аммония (насьЕдение в 40%) . Получают изоцитратдегидрогеназу, обогащенную до специфической активности в 50 ИЕ/мг..

I