Штамм @ @ ВКМ В-1458-продуцент лизин-2-монооксигеназы Советский патент 1987 года по МПК C12N9/04 C12N1/20 C12N9/04 C12R1/38 

113

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, а именно к получению ферментов микробного происхождения и представляет собой штамм бактерий - продуцент фермента лизин- -2-монооксигеназы /КФ 1,13.12.2/ /ЛКС/ который может быть использован в микробиологической и медицинской промьш - ленности, а также в медицине.

Цель изобретения - выявление нового штамма бактерий Pseudomonas pu- tida, обладающего повышенной активностью лизин-2-монооксигеназы и удешевление целевого продукта.

Штамм отобран при сканировании микроорганизмов рода Pseudomonas, хранящихся в ВКМ и во ВНИИ сельскохозяйственных микроорганизмов г. Ленинграда :

Pseudomonas

fluorescens ВКМ Б-1470/В-28/ ВКМ Б-1471/В-22/ ВКМ В-1472/В-23/ ВКМ В-1473/В-25/

Pseudomonas

putida ВКМ В-1458/В-20/ ВКМ В-1459/В-21/ ВКМ В-1460/В-34/ ВКМ В-146 /В-39/

Pseudomonas

fluorescens70/314

71/405

Лизин-2-монооксигеназная активность обнаружена при культивировании на жидкой синтетической среде, содержащей- L-лизин в качестве единственного источника углерода и азота в количестве 3-4 г/л в условиях аэрации в штаммах:

Pseudomonas

fluorescens ВКМ В-1470/В-28/

Pseudomonas

putidaВКМ B-I458-/В-20/

ВКМ В-1450/В-34/

Pseudomonas

fluorescens70/314

Наибольшей активностью обладает штамм PS. putida ВКМ В-1458/В-20/, имеющий- следующие культурально-морфо логические и физиолого-биохимические свойства: время генерации в МПБ 60- 70 мин; клетки грамотрицательные, палочкообразные, размером 1-3 мкм, подвижные, двигаются с помощью полярных жгутиков, бесцветные, при ферментации выделяют в культуральную жидкость пигмент зеленого цвета - пио- вердин. На МПА после 24 ч инкубации

72

при 25°С образуются округлые колонии диаметром 2-3 мм беловато-серые, непрозрачные, гладкие, блестящие с правильными краями. В центре колонии образуется небольшая выпуклость. При хранении колонии становятся мукоидны- ми. Хорошо растет на МПА и в МПБ рН 7f2-7,5, На агаризованной синтетической лизинсодержащей среде после 48 ч

инкубации размер колоний достигает 1-2 мм. Форма и цвет аналогичны. При культивировании в жидкой синтетической лизинсодержащей среде выделение пиовердина происходит нерегулярно и

зависит видимо от качества дистиллированной воды. Показано, что присутствие ионов железа стимулирует образование пиовердина. Температура вьщ|е 30 С подавляет рост культуры на синтетической среде.

Культура поддерживается на МПА. Оптимальная температура роста 24- . При культивировании МПБ лизин- -2-монооксигеназной активности не наблюдается. Она проявляется только при культивировании микроорганизма на синтетической лизин-содержащей среде.

Внутриклеточная ЛМО проявляет максимальную активность к 45-55 ч роста культуры на жидкой синтетической среде на поступательной качалке (100 качаний в минуту).

Лизин-2-монооксигеназную активность определяют амперометрически по убыли концентрации кислорода в ячейке с перемешиванием объемом 5 ил. Реакционная смесь содержит 0,05 М калий-фосфатный буфер рН 8,0 и 0,02 М

лизин. Реакция инициируется добавлением 0,07 мл бесклеточного экстракта.

Пример 1. Культивирование продуцента лизин-2-монооксигеназы штамма Pseudomonas putida ВКМ В-1458 /Б-20/ проводят на поступательной качалке (100 качаний в минуту) при 25°С в конических колбах объемом в 1 л, содержащих по 200 мл синтетической среды следующего состава, %:

L-лизин 0,3; КзИРО -ЗН О 0,15; 0,05; MgSO -7,20 0,02 (в дальнейшем синтетическая лизинсодержащая среда). Посевным материалом служит культура

микроорганизмов, выращенных на поверхности скошенного мясопептонного агара, в течение 36 ч. Одной пробиркой со скошенным агаром засевают одну ферментационную колбу. Длительность

1310427

культивирования 55 ч. В процессе культивирования рН не поддерживают. После 55 ч роста культуральную жидкость центрифугируют, клетки промывают 0,05 М калий-фосфатным буфером рН 8,0 вновь ресуспендируют в том же буфере, разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора УДЗН-1 и центрифугируют. В термостатируемую ячейку объемом 5 мл, содержащую 20 мМ раствор L-лизииа в калий-фосфатном буфере рН 8,0 вводят 70 мкл грубого клеточного экстракта и измеряют скорость потребления кислорода мембранным кислородным электродом в течение 1 мин, после чего рассчитывают активность фермента. За единицу активности ЛМО принимают то ее количество, которое расходует 1 микромоль кислорода в минуту. Полученная таким образом активкость составляет 29,8 Е/г биомассы.

Пример 2. Культивирование продуцента проводят так же, как в примере 1,. но посевным материалом служит культура возрастом 60 ч, выращенная на синтетической агаризованной лизинсодержащей среде.

Длительность культивирования 45 ч после чего клетки обрабатываются так же, как в примере 1. Полученная при

Редактор И.Сегляник

Составитель И.Привалова

Техред М.Ходанич Корректор С.Шекмар

Заказ 1868/26Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

этом активность ЛМО 30,1 Е/г биомассы.

Пример 3. Условия культивирования продуцента повторяют условия примера 2, но для удешевления среды используют в качестве источника углерода и азота в синтетической среде технический лизин с содержанием основного вещества 86%. Активность ЛМО 30,1 Е/г биомассы.

Таким образом, предлагаемый штамм Pseudomonas putida В-1458 /В-20/ обепечивает повышение активности целевого продукта с 19,8 до 30,1 Е/г биомассы по сравнению с известным. В процентном отношении это означает увеличение активности на 51%. Использование технического лизина позволяет существенно удешевить стоимость ростовой среды, а следовательно и (фермента.

Формула изобретения

Штамм Pseudomonas putida ВКМ В-1458 (Всесоюзная Коллекция микроорганизмов ИВФМ АН СССР, коллекционный номер ВКМ В-1458 Д) - продуцент лизин-2-монооксигеназы.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения - выявление нового штамма бактерий Pseudomonas putida, обладающего повышенной активностью лизин-2-монооксигенаэы, и удешевление целевого продукта. Штамм отобран при сканировании микроорганизмов рода Pseudomonas, хранящихся в ВКМ. Штамм проявляет максимальную активность при культивировании на жидкой питательной среде, содержащей 3-4 г/д лизина или технического лизина, в течение 45 ч, равную 30,1 Е/г биомассы. Посевным материалом служит культура продуцента возрастом 60 ч. 4 ND