Способ получения дегидрогеназ Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно, к способу получения дегидрогеназ микробиологическим путем,j

Известен способ получения дегидрогеназ , предусматривающий культивирование бактерий рода Pseudbmonas на питательной среде, содержащей источ- Q НИКИ углерода, азота, фосфора и минеральные соли, дезинтеграцию с последующей обработкой бесклеточного экстракта сульфатом стрептсмицина, сульфатом аммония и очистку фвряент- ного препарата 1 ,

в качестве источника фермента используют бактерии Pseudoraonas multivoraus, выращенные на среде с глюкозой. Выход глюкозо-6-фосфат ди- 20 гидрогеназы 30%, активность 140 ед/мг белка.

Известный способ предполагает получение только одной, а именно, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы.25

Недостатками известного способа являются невысокий выход фермента и использование г.Г1юкозы в. качестве рубстрата для выращивания бактерий.30

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и удешевление .его.

Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента используют штамм Pseudomonas oleovorans 52, выращенный на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода метанол или метиламин, а очистку ферментных препаратов проводят фракционированием на сефадексе G-150 и хроматографированием на ДЭАЕ-агарозе с получением фракций,содержащих глюкозо-б.-фосфат дегидрогеназу и 6-фосфоглюконат дегидрог.еназу.

Посл.е хроматографии на ДЭАЭ-агарозе. фракцию, сод-ержащую 6-фрсфоглюкрнат дегидрогеназу, допйлнительно очищают, на колонке с фосфоцеллюлозой.

Способ осуществляют следующим образом .

Штамм Pseudomonas oleovorans 52 выращивают в течение 24 ч на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода 2-5% метанола или метиламина. Клетки отделяют, разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора, белки экстрагируютбуферным раствором. Белковый экстракт обрабатывают последовательно сульфатом стрептомицина и сульфатом аммония.По лученный ферментный препара т фракционируют на колонке с сефадексом G-150, Фракцию, содержащую обе дегидрогеназы, хроматографируют на колонке с ДЭАЭ-агарозой для их разделения. Выход глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы 35-40%, удельная активность 160-170 ед/мг белка. Фракцию, содержащую 6-фосфоглюковат дегидрогеназу, полученную после хроматографирования на ДЭАЭ-агарозе далее хроматографируют на колонке с фосфоцеллюлозой, Выход 6-фосфоглюконат дегидрогеназы 15-20%, удельная активность 15-17 ед/мг белка. Характеристика штамма PseudomonaS oleovorans № 52. Штамм выделен из активного ила и хранится в коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ, Морфология и культуральные свойства. Грс1мотрицательные подвижные палоч ки с одним полярным жгутиком. Средний размер клеток 1,0-1,8 х «0,4-0,7 мкм. Колонии на МПА-округлые гладкие , выпуклые,непрозрачные,белые ари старении приобретают цвет кофе с молоком,до 1 мм в диаметре,края ров ные, структура однородная, легко сни маются с агара петлей. Культура обил но растет на МПА, на сусле-агаре и голодном агаре роста нет. Физиология и биохимические свойства. Штамм 52 - облигатный аэроб, же латину не разжижает, молоко не пептонизирует; сероводород и ачмиак при росте на МПБ не образует; нитраты во станавливает до нитритов и далее до газообразных продуктов. Оптимальная температура для роста 25-27°С, опти мальное значение рН 7,0-8,0.Штамм растет на средах с углеводородами (гексадекан) и спиртами (метанол, этанол, пропанол, н-бутанол, изобут нол и глицерин). Из органических кислот рост бактерий обеспечивают малат, сукцинат, пируват, цитрат, л тат, бензоат, бутират, фумарат, гли колат; из углеводов-глюкоза, сахаро за, фруктоза, мальтоза, рамноза, галактоза, ксилоза. Из одноуглеродных соединений Ps.oleovorans № 52 наряду с метанолом использует метил амин, но не растет на средах с форм альдегидом, формиатом, диметиламином и триметиламинс. При росте на средах с метанолом,метиламином и др гими субстратами образует большое количество полисахаридной слизи. Ис пользование одноуглеродных соединений PS.oleovorans 52 осуществляе.тся поср)едством гексулоэофосфатного цикла (вариант Энтнера-Дудорона) . Пример 1.Pseudomonas oleovorans №52 выращивают в ферментере с рабочим объемом 70 л на среде следующего состава,-(г на 1 л среды) 2,0; NaCl 0,5; (NHj),,SO4 2,0; MgS04 0,025; FeSO. 0,01; метанол 5,0, рН среды доводят до 7,2 10%-ным раствором NaOH. Температура выращивания -30с, скорость перемешивания - 600 об/мин аэрация - 0,5 объема воздуха Ё минуту на 1 объем среды. После 24 ч куль тивирования клетки собирают на сепа-раторе АСГ-ЗМ. Все дальнейшие операции проводят при + 4°С. В качеству буферного раствора используют 20 мМ трис-НС1, рН 7,1 содержащий 2,5 мй MgCIjj и 10 М дитиоэритритола (буфер А). Клетки (100 г) разрушают на уль тразвуковом дезинтеграторе MSE (20 кГц 3x1 мин), белки экстрагируют буфером А и освобождают от клеточных обломков и неразрушенных клеток центрифугированием (20000д, 40 мин). К экстракту добавляют сульфат стрептомицина до концентрации 1%, центрифугируют (lOOOOg, 20 мин) и осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 50%-ного насыщения. Осадок отбрасывают.- Ферменты осаждают, доводя концентрацию сульфата аммония до 60%-ного насыщения. Осадок растворяют в минимальном объеме буфера А, Нерас творившийся осадок удаляют центрифугированием (20000д, 15 мин). Раствор наносят на колонку с Сефадексом G-15О (250 мл) и элюиpyioT ферменты буфером А, Фракции элюата, содержащие обе дегидрогеназы, наносят на колонку с ДЭАЭ-агарозой, Фракции элюата, содержащие 6-фосфоглюконат дегидрогенаэу, диализуют против 0,05 М ацетного буфера, рН 5, 6, содержащего дитиоэритритола и Наносят на колонку (40 мл) с фосфоцеллюлозой. Фермент элюируют градиентом, концентрации NaCl в том же буфере (0-0,4 М). Далее препарат концентрируют переосаждением сульфатом аммония или на колонке с ДЭАЭ-агарозой. К полученным щзепаратам для стабилизации ферментов прибавляют глицв-) до концентрации 50%. Выход глюкозо-6-фосфат дегидрогенаэы 40%, удельная активность 170 ед/мг. Выход 6-фосфоглюконат дегидрогеназы 20%, удельная активность 17 ед/мг белка, iT р и М е р 2.Способ осуществляют согласно примеру 1,но в качестве источника углерода используют 5 г/л метиламина. Выход ферментов и их удельная активность соответствуют полученным . в примере 1, Описанный способ позволяет получить в одксал процессе глюкоэо-6-фосфат дегидрогеназу и 6-фосфоглюконат

дегидрогенаэу с хорошим выходе и 13ЫСОКОЙ удельной активностью, а также использовать в качестве субстратов дешевое непищевое сырье взамен глюкозы.

Формула изобретения

1. Способ получения дегидрогеназ, предусматривающий культивирование бактерий рода Pseudomonas на питательной среде, содержащей источники углерода, азота.фосфора и минеральные соли, дезинтеграцию с последующей- обработкой бесклеточного экстракта сульфатом стрептомицина, сульфатом аммония и очистку ферментного препарата, отличающийся тем, что, с целью повыиения выхода . целевого продукта и удешевления его, в качестве,продуцента используют

штамм Pseudomonas oleovorans 52, выращенный на питательной среде,содержащей в качестве ис-ГОчника углерода метанол или метиламин, а очистку ферментных препаратов проводят фракционированием на сефадекср G-150 и хроматографированием на ДЭАЕ-агарозе с получением фракций, содержащих глюкозо-б-фосфат дегидрогеназу и 6-фосфоглюконат дегидрогеназу,

2. Способ поп,1, отличающийся тем, что после хроматографии на ДЭАЕ-агарозё фракцию, содержащую б-фосфоглюкЬнат дегидрогеназу, дополнительно очищают на колон5ке с фосфоцеллюлозой,

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

il, Vander Wyk J.C., Lessie T.G. The Journal of Bacteriology 120.

0 1033, 1974.