Способ получения фермента, окисляющего холестерин до перекиси водорода и холестенона Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к области микробиологии.

Способ получения фермента, окисляющего холестерин до перекис;и водорода и холестенона заключается в том, что биомассу микроорганизмов-продуцентов экстрагируют буфером, содержащим неионогенное поверхностно-активное вещество и выделяют целевой прод кт из бесклеточного экстракта, кроме того в качестве продуцента используют культуру ProactijioJnvce eivthropotis штамм NBC 9158. или ЛТСС 17895,или АТСС 42 77,или культуру Bocardioi formica штамм АТСС 14811,

Микроорганизмы разлагают, растворяют и извлекают с помощью буферного раствора, содержащего неионогенное поверхностно-активнае средство.

Предпочитаекыьда неионогенными поверхностно-активными средствами являются ёьпкиларилэтиленг. и аддукты окисей полиэтилена и полипропилена, в особенностг: их сложные эфиры. Принципиальная концентрация пов ерхностно-активного средства в используемом для разложения (растворения) и для экстрагирования в буферном растворе зависит от применяемого поверхностно-активного средства и может определяться с помощью предварительных испытаний. При

годны концентрации 0,01-3%, преимущесвенно 0,1-1%. РН буферного раствора 5-9, предпочтительно 6-8.

Ьсобенно хорошие результаты получаются, если микроорганизм перед растворением и перед экстракцией в прису ствии поверхностно-активного средства промывают смесью бутанола и воды.

Полученный экстракт, содержащий в растворе Фермент, очищают на ионообменнике.

В качестве ионообменника применяют анионообменные смолы, в особенности слабобазисные сорта, предпочтительными ионообменниками являются и те, которые несут диэтиламиноэтаноловую группу.

Вымывание ионообменника осуществляют 0,01-0,2 М буферным раствором с рН 5-9. Концентрация поверхностно-активного средства:преимущественно 0,052%.

Предпочтительно применение 0,03- 0,1 М фосфатного буферного раствора с содержанием 0,2-0,7% поверхностноактивного неионогенного средства.

Из полученного таким путем элюата фермент осаждают с помощью солей или органических растворителей, например сульфата аммоккя, метанола и других.

Для повторного растворения, осажденного фермента применяют.. буферный раствор, который содержит небольшое количество поверхностно-активного 1гредства.5

Фермент, полученный после и нооб шнного вымывания можно использовать непосредетвенно для количественного определения холестерина согласно уравнению «О колестёрин (НН) ( О,холестенон4-НаОйАктивность фермента и эффективность предла аемого способа определяют благодаря тому, ЧТО1 образукадуюся фракцию HgO замеряют по известным методам оп- , ределения

Микроорганизмы выращивают на среде из минеральных солей, содержащих пептон; и как только достигают логариф;ьшчвской фазы роста, ;добавляют водиую эмульсию, которую изготавливают путем мокрого размола водной суспеввчи холестерина и последующей стерилизацией при высокой температу зе.

Таким Ьбразом удается достичь 100% использования холестерина в течение 25 односуточного выравнивания культуры (| шкроорганизма) при выходе L-2 г чисгой субстанции сухих клеток. Бульон с купьтуроП добавляют в таком колидестве, что задают 1-20 г холестерина 30 йа каждый литр в период роста. Загруэку осуществляют порциями по мере микроорганизмов.

Небольшое количество холестерина добавляют в бульон с культурой ещё в ад начале роста, т.е. перед достижением логарифмической фазы роста.

В качестве питательной среде исполь- ауют водный.раствор, содержащий вес.%s 0,1-2 пептона, 0,01-0,2 , 0,05i , 0, гептагидрата суль ата магния, которая содержит следы хлорида железа и хлорида кальция, рН 6-9. Начсшьная загрузка холестерина составляет 0,01-0,1%.

Удельное содержание фермента до 7 V/r сухой массы бактерий и 1-3,5 г сухой массы бактерий на .каждый литр йигательной среды.

Удельное содержание микроорганизвж в в ферменте удается, увеличить благодаря тому что лшкроорганизм сна«аала вЕзраашвают на ацетате и затем на холестерине в качестве единственного |йсточника углерода,.

Так, например при выращиваний-мик- роорганизмбв на среде из минеральных солей с указанным выше составом, но при замене пептона ацетатом вколичестве 0,5 вес,% до начала добавления холестериновой эмульсии достига- Йй ют повышения удельной активности до 24 V/r сухой массы, одновременно увеличивается содержание сухой массы до б,5-г/л. Значительное повышение содержания сухой масйы и активности до- g$

ртигают благодаря тому, что к водной суспензии холестерина добавляют в качестве эмульгатора небольшое количестйо 0,02-1, предпочтительно 0,05-0,3 вес.-% дрожжевого экстракта.

Предпочтительная питательная среда состоит из водного раствора с содержанием 0,1-2 вес.% ацетата (ацетата чм мония), 0,01-0,2 вес,% KgHPO,, 0,051 вес.% , 0,05-0,l вес.% сульфата магния в качестве гептагидрата, следовхлорида железа и хлорида кальция с величиной рН 6-9. При достижении логарифмической $азы роста ацетат эаменяют хо.естерином. Чтобы величина рН в период эьфащивания оставалась постоянной, ttenpeiX:iBHO или порциями загружают кислоту. Во время фаз роста с помощью ацетата в качестве источника углерода применяют уксусную кислоту, как только переходят на холестерин, уксусную кислоту заменяют минеральной кислотой. В этой второй стадии роста npHMeansTt соляную кислоту для р«гулирован11Я величины рн. При этом достигают активность до 30V/r сухол ы&ссы,

; Пример 1.2л питательной среды, состоящей из вес.% казеинового пептона, 0,05 вес.% , 0,2 вес,% H KjPOv, 0,02 вес.% гепта-гидрата сульфата магния, следов хлорида железа и хлорида кальция в водопроводной водо и с помощью КОН регулируют величину рН 7,5, засевают в качающейся колбе с 200 мл хорошо вы рсшей предварительной культуры Р г OCSC i 1 по m у с е 5 er-vthropogig ЫВ(СГ Э15Жи сильно вентилируют иа магнитной мешалке. С началом логарифмической фазы роста, определяемой по возникающему увеличению помутнания, в период дальнейшего В1:фащивания периодически загружают приготовленную с помощью мокрого размола, стерилизованную холестериновую эмульсию,таким образом, что в течение 20 ч в колбу загружают 10 г холестерина. Через 5 ч после по- следней загрузки клеточную массу собирают nyteM центрифугирования. Получают 4 г сухой массы бактерий. После расщепления с помощью ультразвука получают 3V/г фермента.

Пример 2. в сосуде культивируют 15л описанной в примере 1среды вместе с 0,5л хорошо выращенной предварительной культурой PfoactinoTTtTces ervttirpogis АТСС 17895 при сильной аэрации.С самого начала загружают 0,05% холестерина.С началом логарифмического рос та непрерывно загружают cтepилизoвaнt ную холестериновую суспензию в течение дальнейшего выращивания, так что в ферментер загружают в целом 50 г холестерина за 15 ч выращивания. При этом получают бактериальн то массу в 40 г. Из бактериальной массы посредством расщепления (разложения) ультразвуком получают 7,1 V /г фермента.

Приме р 3. Как описано в примере 2, в рабочем объеме 60 л культивируют бактерии Prooctinomyces .erylhropofis (ВС 9158) . Приблизительно через 25 ч вводят свежую питательную среду в сосуд для выращивания бактерий и забирают раствор с вьфосшей культурой из этого сосуда.

Одновременно в ферментатор вводят холестериновую суспензию; за 1 ч загружают около 3 г холестерина. Таким образом при непрерывном выращивании получеиот 1,2-1,5 г/л бактериальной сухой массы с одинаковой удельной активностью.

Пример4. В ферментаторе емкостью 20 ПК 15 л питательной среды, состоящей из 0,5 вес.% ацетата аммония, 0,05 вес.% вторичного фосфата калия, 0,2 вес.% первичного фосфата аммония, 0,02 вес.% гептагидрата сульфата магния и следов хлориду железа и кальция в водопроводной воде, засеивают 0,5 л хорошо выращенной предварительной культуры бактерий Proactinomjce rythrofotiA ЫВС 9158 и культивир1тот пр сильной аэрации.

Величину рН культуры поддержива от постоянной посредством текущей,загруз ки 20%-ной уксусной кислоты до конценрации биомассы около 1,5 г/л. После достижения этого содержания стерилизованную суспензию непрерывно загружают в ходе дальнейшего выращивания таким образом, что в целом в ферментатор загружают 30 г холестерина в течение 20 ч выргшшвания культуры. Холестериновая суспензия содержит 0,1-0,2% дрожжевого экстракта. Зааем для нейтрализации культуры вместо уксусной кислоты используют разбавленную соляную кислоту.

После завершения культивирования биомассу с помсяцыо центрифугирования отделяют от раствора культуры.

Примерз. При двухступенчатом непрерывном способе выращивания комбинируют два ферментатора с рабочими объемами 15 л для первой и 70 л для второй ступени таким образом, что при часовом протоке 4 л, описанной в примере 1 питательной средаа получается доля протока 0,25-0,30 для первой ступени и 0,055-0,065 для второй. К началу культивирования вторую ступень засевают хорошо выращенной предварительной культурой бактерий Prvac-. tinomyces eirithropolis , ATGC 17895 В количестве 1,5 л и вторую ступень засевают такой же предварительной культурой в количестве 0,5 л при сильной; аэрации обеих ступеней, причем первую ступень нейтрализуют с помощью уксусной кислоты, а вторую ступень с по(ющыо соляной кислоты.

Одновременно во вторую ступень включают систему притока (4 л питательной среды/чар). Величину рН выдерживают 7-7,5. Таким образом за 1 ч получают 4 л бульона с культурой при 7 г/л при активности 30 /г сухой массы. Раствор культуры собирают в охлажденном резервуаре и бактериальную массу выделяют из него на непрерывно действующей центрифуге. Для регулирования виличины рН в первой ступени на каждый час требуется приблизительно 10 г :100%-ной уксусной киспоты.

fipHMepS. 40 мл суспензии с бактериями Hocapdia erythropofis (около 10 г сухой массы)примешивают к 40 мл 1г -бутанола и в течение нескольких минут перемешивают при комнатной температуре. Смесь центрифугируют и из нее удаляют бутанол и лишнюю водную фазу. Осадок снова примешивают к 40 мл воды и после изготовления гомогенной суспензии клеток снова при-мешивают к 40 мл п -бутанола, несколко минут-перемешивают и. центрифугиру-t ют. Осадок суспендируют в 40 мл 0,01 ; буферного раствора фосфата (рН 7,0), к которому добавляют 0,3% неионогенного поверхностно-активного средства (алкиларилполиэтиленгликоль) и перемешивают в течение 30 мик при комнат- ной температуре. Затем центрифугируют и оссщок извлекают. Экстракт содержит около 120 ед. фермента с уделаИой активностью 3 ед/мя протеина.

Этот экстракт примешивают к твер- ; дому сульфату аммония до концентра,ции 1,3 М в сульфате аммония при температуре О С, затем суспензию центрифугируют, осадок собирают на основе очевидной липофильной доли на поверхт ности раствора. Спеченный осадок фил$труют, рас-рворяют с 0,01 М буферного раствора фосфата, рН 7 и при температуре О С подвергают диализу по отношению к тому же буферному раствору, Диализированный раствор пропускают через уравновешенную с помощью 0,01 М фосфатного буферного, раствора колонну товарного анионита с диэтилЬминоэтаноловыми группами на основе дэкстрана. При этом фермент адсорбируется. После промывки колонны с помощью того же буферного раствора npoj изводят последовательно промывку растворами с 0,5%, 2% и 5% указанного вы-Ь ше поверхностно-активного средства в воде. При этом вымываются большие количества загрязнений.

Затем последовательно, осуществляют промывку с помощью 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН - 7; 0,05 М фосфатного буферного раствора, рН - 7, 0,2м фосфатного буферного раствора, рН 7, и 0,5 М фосфатгчого буферного раствора рН 7. Затем снова п5юизводят промывку с помощью 0,05 М фосфатного буферного раствора (рН 7) и фермент с 0,05 М фосфатного раствора, к которому добавляют 0,05% поверхностно-активного сред ства, вымьгаается. В элюате находятся около 80% адсорбированной на колонне ферментной активности в ферменте с удельной активностью 25-30 V/мг протеина. Пример 7. Повторно осуществляют способ по примеру 6, но промывку во дой с бутанолом не производят,Таким об разом, получают экстракт для высг1живания сульфата аммония, который содержит около 120. ед. фермента с удельной активностью в 1ед/мл протеина. Дальнейшее обогащение известным способом приводит к получению продукта с удельиой активностью 8-10 V /мг протеина. Примере. Повторяют способ по примеру 6, но вымывание анионита осу1гествляют с помощью водного раствора, кото1илй содержит 5% такого же поверхностно-активного средства в растворенном состоянии. Фермент поглощается из внионита (анионообменной смоле). Формула изобретения 1.Способ получения фермента, скислякидего холестерин до перекиси водорода и холестенона,отличающийс я тем, что биомассу микроорганизмовпродуцентов экстрагируют буфером, содержгшшм неионогенное поверхностно-активное вещество и выделяют целевой продукт из бесклеточного экстракта. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве проду-, Цента используют культуру Proociinomyoes «r thropotis штамм КВС 9158, или АТСС 17895, или АТСС 4277, или культуру НосалКа formica штамм АТСС 14811