Способ получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/04 C12N9/04 C12R1/40 

00

С

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 3-гидро- ксибутиратдегидрогеназы, которая находит применение в клинико-химической диагностике для количественного определения кетонных тел. Цель изобретения - снижение себестоимости конечного продукта. Изобретение состоит в том, что штамм Pseudomonas putida ATCC 17633 выращивают на тех субстратах, при распаде которых возникают ацетоацетат или гидроксибути- рат являющиеся одновременно источниками углерода. К ним относятся D, L-лейцин, D, L-лизин, D, L-каротин, алифатические углеводороды с длиной цепи Сб-Сю. Культивирование ведут в течение 15-40 ч, а хроматографическую очистку фермента осуществляют на 10-карбоксидецилсефарозе. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 3-гидро- ксибутиратдегидрогеназы который находит применение в клинико-химической диагностике для количественного определения кетонных тел.

Известен способ получения 3-гидро- ксибутиратдегидрогеназы. Для этой цели выращивают бактериальный штамм Rhodopseudomonas spheroides на 3-гидро- ксибутирате, как источник углерода, затем отделяют бактерии посредством центрифугирования, обрабатывают их и подвергают свободный от клеток белковый экстракт, имеющий начальную активность порядка 0,1 моль/мин/мг белка, воздействию прота- минсульфата для осаждения и последующего удаления нуклеиновых кислот. После фракционирования посредством аммоний- сульфатного осаждения соответствующая фракция отделяется, промывается, растворяется в буфере и очищается или же обогащается многократно хроматографически до активности порядка 17 моль/мин/мг белка.

Способ имеет тот недостаток, что конечный продукт очень дорог, особенно если дело касается сильно обогащенной 3- гидроксибутиратдегидрогеназы. Причина не только в трудоемкости операции очистки, но и в высокой стоимости субстрата для культивирования. Недостаток состоит и в том, что активность получаемого фермента не превышает значения в 17-20 моль/мин/мг белка. Причина втом, что применяемый штамм Rhodopseudomonas spheroides не в состоянии производить фермент с более высокой начальной активностью, чем вышеописанной.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сути является способ получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы,предусматривающий выращивание штамма

XI

СО 00

со

Pseudomonas lemoignei на питательной среде в присутствии цитрата и сукцината в качестве субстрата при температуре 30°С и аэрации с последующим отделением клеток, приготовлении бесклеточного экстракта фракционным осаждением сульфатом аммония и хроматографическую очистку на ДЕАЕ целлюлозе и гидроксианкатите до обогащения фермента активностью 190 ммоль/мин/мг. Способ трудоемок. В 4 частях способа осуществляют в среднем 6 единичных шагов, причем необходимое проведение диализа забирает много времени. Достигнутая высокая активность на 50% обязана активированию фермента ионами Мд44, вследствие чего картина при сравнении с другими стандартными методиками изменяется.

Цель изобретения - снижение себестоимости конечного продукта.

Цель достигается путем выделения фермента 3-гидроксибутиратдегидрогеназы из штамма Pseudomonas putida ATCC 17633. Штамм сохраняли преимущественно на бульоне с 2 %-ном агаром при 4°С в темноте. Культивирование Pseudomonas putida осуществляют в субмерсионной культуре на жидкой минимальной среде после пересе- вания из первичной культуры при 20-40°С (преимущественно при 30°С). Выращивание проводят на тех источниках углерода, при распаде которых образуются ацетоацетат и гидроксибутират. Такими источниками углерода являются, например, D, L-лизин, D, L-лейцин, D, L-карнитин и т.д. и, кроме того, неразветвленные углеводороды с длиной цепи . В качестве источников азота применяют NH4CI, ( и т.п. После выращивания в течение времени 5-40 ч в зависимости от физиологического состояния и количества высеваемого материала бактерии собирают, например, путем центрифугирования, промывают фосфатным буфером и в заключение превращают в бесклеточный грубый экстракт, например, путем обработки ультразвуком при близких к точке замерзания температурах с последующим центрифугированием. Находящийся в грубом экстракте фермент проявляет в зависимости от источника углерода специфические активности (табл. 1).

С помощью фракционного осаждения или же экстракции солями, например, с сульфатом аммония, осуществляют 10-15- кратное обогащение фермента. Для этого целесообразным является разведение белкового экстракта с последующим осаждением подавляющего количества белка 70%-ным сульфатом аммония.

Полная активность остается при этом в седименте. Для дальнейшего обогащения 3- гидроксибутиратдегидрогеназы осадок последовательно обрабатывают при 4°С растворами сульфата аммония, которые содержат 0,05 моль/л Трис, при понижающейся концентрации (NH4)2SCM и в каждом случае путем пятиминутного перемешивания. При этом фермент все больше растворяется. Основная масса фермента растворяется в районе концентраций между 35 и 20% насыщения раствора сульфата аммония. Фермент переосаждается путем добавления сульфата аммония до конечной концентрации в 50%.

На гидрофобном носителе, таком как, например, 10-карбоксидецилсефароза, возможно дальнейшее обогащение фермента. При этом на колонку, заполненную 10-кар- боксисефарозой, сажается фермент в 20% насыщения раствора сульфата аммония. После промывки раствором сульфата аммония этой же концентрации производят фракционное элюирование с 17% насыщения рас- твора сульфата аммония. В первой фракции наблюдается 4-кратное и во второй - 7- кратное повышение специфической активности. Адсорбции способствуют сутруктуроформирующие ионы, такие как фосфат, цитрат и сульфат. Полученный согласно изобретению фермент хорошо сохраняется. При специфических активностях в 10-20 моль/мин/мг белка доказываются следующие максимальные чужеродные активости, %:

Алькогольдегидрогеназа 1 %

Малатдегидрогеназа 0,02

Лактатдегидрогеназа 0,001

В процессе выращивания бактериальной культуры выгодно работать со ступенчатым дефицитом кислорода.

Пример. Pseudomonas putida (PpG 6) ATCC 17633 выращивают в субмерсионной культуре в жидкой минимальной среде. Среда содержит на литр: 6,97 К2НР04, 1,5 г NaH2P04, 0,2 г MgSCM 7 Н20, 7,5 мг FeSCMx х7 Н20, 0,75 мг MnSCM -4 Н20, 0,75 мг ZnS04 H20, 0,15 мг CuS04 5 Н20, 0,15 мг CoCl2 6 Н20 и 0,15 мг борной кислоты.

В качестве прививочных культур служат предварительные культуры, у которых к жидкой минимальной среде добавляют экстракт дрожжей (0,4 г/л) и глюкозу (10 г/л).

При культивировании на D, L-карнитине последний добавляют в концентрации 2 г/л

как единственный источник углерода и азота. При культивировании на других источниках углерода (10 г/л) в качестве источника азота применяют МНЦС (3 г/л). После выращивания в течение 15 ч бактерии собирают центрифугированием, промывают многократно фосфатным буфером (0,067 мол ь/л, рН 7,5) и разрушают в заключение посредством обработки ультразвуком при 4°С. Грубый бесклеточный экстракт получают с помощью центрифугирования, разводят его 0,067 моль/л фосфатным буфером (рН 8) до достижения концентрации белка в 5-20 мг/мл,

Подавляющую часть белка осаждают при 4°С из этого раствора посредством до- бавления сульфата аммония до 70% насыщения.

Полная активность 3-гидроксибутират- дегидрогеназы находится при этом в осадке. После центрифугирования седимент суспендируют при 0°С в растворе сульфата аммония (45% насыщения в 0,05 моль/л Трис) и после этого снова центрифугируют. В седименте остается полная активность, Для дальнейшего обогащения остаток пере- мешивают по 5 мин при 4°С с растворами сульфата аммония, содержащие каждый 0,05 моль/л Трис-HCI, рН 8 понижающихся концентрацией.

Фермент растворяется при этом в воз- растающей мере, преимущественно в районе концентраций между 35 и 20% насыщения сульфатом аммония (табл. 2).

Фермент переосаждают снова посредством добавления сульфата аммония до ко- нечной концентрации в 50% насыщения.

После центрифугирования фермент суспендируют в 3,2 моль/л раствора аммония, рН 7, и сохраняют при 4°С. Для дальнейшего обогащения 1 мл раствора фермента в сульфате аммония 20% насыщения сажают на 2-х мл колонку с 10-карбоксисефарозой. Специфическая активность составляет 11 и моль/мин/мг белка, общий белок - 1,5 мг Полная активность остается на носителе После промывания 10 мл раствора сульфата аммония (20% насыщения) на колонку подают последовательно по 2 мл раствора сульфата аммония (17% насыщения). В пол

ученных двух фракциях находится вся активность, но только 25% белка.

Специфическая активность составляет в I фракции 41 /и моль/мин/мг белка (0,3 мг белка) и во II фракции - 80 /л моль/мин/мг белка (0,1 мг белка).

Суспензии фермента сохраняют в насыщенном растворе сульфата аммония. После 6 мес сохранения при 4°С потеря активности 3-гидроксибутиратдегидрогеназы не наблюдалась.

Специфическая активность 3-гид- роксибутиратдегидрогеазы в грубых экстрактах из Pseudomonas putida полсе роста на ацетоацетатобразующих субстратах для культивирования приведена в табл.1

Результаты очистки 3-гидроксибутиратдегидрогеназы (субстрат для культивирования 0,-карнитин) из Pseumonas putida ATCC 17633 приведены в табл.2. Получение проводили из 17 мл грубого экстракта (7,5 мг/мл белка).

Формула изобретения

Способ получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма рода Pseudomonas на питательной среде, содержащий источники углерода, азота, минеральные соли - сернокислый магний, фосфорнокислый одно- замещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий, соединения железа и хлора и воду при оптимальной температуре и аэрации с последующим отделением клеток, приготовлением бесклеточного экстракта и перевода его в белковый экстракт фракционным осаждением сульфатом аммония и хроматографическую очистку, о т - личающийся тем, что, с целью снижения себестоимости конечного продукта, в качестве продуцентра используют штамм Pseudomonas putida ATCC 17633, а в качестве источника углерода - D, L-лейцин, D, L- лизин, D, L-карнитин, алифатические углеводороды с длиной цепи , процесс культивирования ведут в течение 15-40 ч, причем хроматографическую очистку фермента осуществляют на 10-карбоксидецил- сефарозе.

Примечание. О- осадок; Н - надосадочная жидкость.

Таблица 1

Таблица 2