Способ получения глутаматдегидрогеназы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/06 

1

со

изобретение относится к микробиологической промышленности, а име но к способу получения глутаматдегидрогеназы, которая используется для определения аммиака, с -кетоглутрата, глутамата.

Известен способ получения глутаматдегидрогеназы, предусматривающий культивирование микроорганизмов ВаciSeus megaterium на питательной , среде, содержащей глюкозу в качеств источника углерода ij.

Известен также способ получения (Тлутаматдегидрогеназы, предусматривающий культивирование микроорганизмов - продуцентов на питательной , среде, содержащей источник углерода и минеральные соли, дезинтеграцию микроорганизмов, получение бесклеточното экстракта с последующим выделением из него фермента с использованием тепловой обработки и хромагографии. Согласно этому способу используют анаэробные микроорганизмы CKostridium SP4, которые выращивают на-питательной среде, содержащей в качестве источника углерода лизин. ,Для вЕдцеления фермента биомассу дезинтегрируют, получают бесклеточный экстракт, который сначала обрабатывают протаминсульфатом, фракционируют сульфа,том аммония, затем подвергают тепловой o6pa6oTj e, повторн фракционируют сульфатом аммония, хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе и Сефадексе-150, Выход фермента 41% активность 485 ед/мг белка 2}.

Недостатком данного метода является сложность процесса, обусловленная йеобходимостью создания анаэробнйх условий культивирования ; (удаление кислорода достигается при помощи реакции его с водородэм в присутствии.катализатора или пропусканием через культуральный сосуд азота), многостадийностью процесса вьщеления, а также 1спользованием в качестве источника углерода ценного продукта - лизина.

Цель изобретения .- упрощение процесса.

Указанная цель достигается тем, что .согласно способу получения глутаматдегидрогеназы, предусматривающему культивирование микроорганиз.мов - продуцентов на питательной среде, содержащей источник углерода и минеральные соли, дезинтеграцию микроорганизмов, получение бескле-точного экстракта с последующим выделением из него фермента с использованием тепловой обработки и хроматографии из микроорганизмов используют штамм MethyBophiCus methanoPo- vorus В-1447Д, культивирование осуществляют в аэробных условиях с использованием метанола в качестве источника углерода, при этом тепловой

.обработке подвергают бесклеточный экстракт, а хроматографию проводят последовательно .сначала на ВРие Sepharose CL-4B, затем на ДЕАЕ - сефар6зе.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве продуцента глутаматдегидрогеназы используют штамм облигатно метилотрофных бактерий MethyBophiPu methanoPovorus ВКМ В-1447Д.

Для получения глутаматдегидрогеназы бактерии ВК1«1 выращивают на питательной среде, содержащей метанол. Клетки отделяют от среды центрифугированием, разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора. После центрифугирования бесклеточный экстракт прогревают 20-40 мин при 50бО С на водяной бане, коагулированны белок отделяют центрифугированием и раствор хроматографируют ка Вбие Sepharose CL-4B. Далее фракции, содержащие глутаматдегидрогеназы, хроматографируют на ДЭАЕ-сефарозе. Выход глутаматдегидрогеназы по отно-. шению к бесклеточному экстракту 5060%, удельная активность препарата 500-550 ед/мг белка.

Приме р. Бактерии MethyKophigus methanoKovprus ВКМ-В-1447Д выращивают в ферментере с рабочим объемом 60 л на среде следующего состава, г на 1 л .среды: КН2РО42,0;

Nace 0,5; (NH4)2 304 2,0 Mgsq,-7Н20

0,025; FeSO4-7H20 0,01; метанол 5,0, рН среды доводят до 7,0 10%-ным раствором NaOH. Температура выращивания , .скорость перемешивания 300 об/мин, аэрация 0,5 объема воздуха в минуту на 1 объем среды. После культивирования (22 ч) клетки собирают на сепараторе АСГ-ЗМ.Дальнейшие операции проводят при +4°С.. В качестве буферного раствора используют 0,05 М Трис-НСС буфер, рН 8,0. Клетки (100 г) суспендируют в буфере и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (20 кГц, мин) гогйогенат центрифугируют (ЗООООс, 40 мин).Бесклеточный экстракт прогревают на водяной бане при 60°С в течение 30 мин и коагулированный белок отделяют центрифугированием.Экстракт наносят на колонку с Вбие Sepharose CL-4B (30 мл) и элюируют раствором .хлористого натрия в буфере, градиент концентрации О - 0,5 М. Фракции, содержащие глутаматдегидрогеназу, объе диняют, диализуют против буфера и наносят на колонку -с ДЭАЕ-сефарозой, йлюируют раствором .-хлористого натри (гргщиент О - 0,5 М). Объединенные фракции, содержащие глутаматдегидрогеназу, обессоливают и к полученному препарату для стабилизации фермента добавляют глицерин до 30%.

310177304

Выход глутаматдегидрогеназы 60%,роститьпроцесс ееполучения,

удельная активность 550 ед/мг белка.Ферментпол учгиотс хорошим

Предложенный-способ получениявыходоми. высокойактивноеглутаматдегидрогеназы позволяет уп-тью.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ, предусматривающий , культивирование микроорганизмов продуцентов на питательной среде, содержащей источник углерода и ми пёральные соли, дезинтеграцию мяк- , роорганизмов, получение бесклеточного экстракта с последующим вьвделением из него фермента с использованием тепловой обработки и хрома.тографии, от лича ющ и йс я iтем, что, с целью упрощения процесса, из микроорганизмов используют штамм Methy ophiJus methanotovorus ВКМ В-1447Д, культивирование осуществляют в аэробных условиях с и 5пользо ваниём метанола в качестве источника углерода, при этом тепловой обра(Л ботке попвергают,бесклеточный экстракт, a хроматографию проводят последовательно сначала на вСие Sepharose CL-4B, -затем на flEAE-Sepharose.