Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, продуцирующий моноклональные антитела к группоспецифическому антигену N системы MNSS эритроцитов человека Советский патент 1992 года по МПК A61K39/395 C12N5/00 

луночной плоскодонной платы. Эффективность гибридизации составляет 87%. Штамм получают в результате двукратного клонирования методом лимитирующих разведений при 100% антителообразующих клонов.

Штамм N-89/4 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий под № ВСКК (II) l h462D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные характеристики. Суспензионная культура клеток в жидкой среде; пассирование 1:2-1:3 через 2-3 сут; клонирование на перитонеальных макрофагах мыши. Среда для культивирования: ДМЕМ, 10%-ной эмбриональной телячьей или оленьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 20 мМ Hepes-буфера, М 2-меркаптоэтанола, 5%-ной среды, кондиционированной спленоцитами мыши, антибиотики; 37°С, 6% СО2 в воздухе.

Культивирование гибридных клеток в организме животного: мыши линии ВАШ/с или их F I гибриды с мышами линий WR или DBA/2 пристан пи 0,25 мл в/бр за 7 сут введения клеток по 1-5 106/мышь. Среднее время роста гибридомы в форме асцитной опухоли 12 сут.

Морфология клеток: штамм представлен слабо прикрепляющимися к субстрату клетками с обычной для антителопродуци- рующих клеток морфологией.

Видовая принадлежность штамма: доказана цитогенетическим методом, Карио- тип соответствует виду Mus musculus. Число хромосом составляет 83-92, генетические маркеры - 1 метацентрическая и 1 большая субметэцентрическая хромосомы.

Сведения о контаминации линии: контаминация бактериями, грибами, микоплззма- ми не обнаружена, вирусы не тестированы.

Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом: .анти-N антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G2b и агглютинирующие эритроциты человека, несущие N антиген. Метод тестирования - агглютинация в солевой среде и на плоскости.

Характеристика полезных продуктов: титр антител в культуральной жидкости в реакции солевой агглютинации в круглодон- ных микроплатах с эритроцитами ON - 1:128-1:256. Титр, антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в микроплзте 1:12800-1:25600. Стабильность антителоп- родукции сохраняется в течение 12 пассажей в культуре.

Криоконсервирование клеток: ростовая среда, 10% ДМСО, 40% любой сыворотки;

сутки при -70°С, затем - жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания 55- 65%.Послеразмораживания

культивирование ведут в 24-луночных пла- тах по 0,5х106 клеток/ячейку на фидере из перитонеальных макрофагов мыши.

Пример. Активность моноклональных антител в серологических реакциях.

Образцы асцитной жидкости, индуцированной клетками штамма N-89/4, исследуют общепринятым методом со стандартными эритроцитами в реакции агглютинации на плоскости и в реакции агглютинации в солевой среде в 96-луночных платах. Под титром антител подразумевают такое их последнее разведение, при котором в ячейке наблюдают агрегаты эритроцитов, а на плоскости крупные агглютинаты начинают образовываться на 2-3 мин. Под авидностью подразумевают сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам, оцениваемое в реакции агглютинации на плоскости по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реакции агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр).

МКА N-89/4 обладают условной слецифичностью, т.е. направлены, по-видимому, к гомологичной терминальной последовательности N формы гликофорина A (ON эритроциты) и гликофорина В (ON и ОМ эритроциты). Как видно из табл. 1, обработка эритроцитов химотрипсином, к которому чувствителен только гликофорин В приводит к исчезновению перекрестной активности полученных МКА с эритроцитами ОМ. При этом титр .антител по отношению к эритроцитам ON, обработанным химотрипсином. снижается всего на одну ступень (одно двойное разведение), поскольку структура гликофорина А сохраняется.

Результаты исследования титра (активности) и авидности МКА, секретируемых клетками штамма N-89/4 и направленных против N антигена системы MNSs эритроцитов человека, представлены в табл. 2. В качестве контроля использованы МКА N-S6/2.

Таким образом, МКА, секретируемые штаммом N-89/4 в асцитной форме, позволяют путем разведения асцитной жидкости в 200 и выше раз получать высокоактивный

специфичный и стандартный реагент анти- N для выявления Н антигена в эритроцитах и других клетках человека.

Как видно из табл. 2, разница в титрах МКА N-86/2 с эритроцитами фенотипа М и М составляет 4 ступени, а разница в титрах

MKA N-89/4 - 7 ступеней (1 ступень - одно двукратное разведение). Это означает, что путем соответствующего разведения МКА N-89/4 возможно создание более активного

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK (П) № и специфичного реагента, не дающего пере- 5 462Д, продуцирующий моноклональные ан- крестных реакций с эритроцитами М фено- титела к группоспецифическому антигену N типа.системы MNSs эритроцитов человека.

Та бли ца 1

Формула изобретения

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического антигена N в эритроцитах человека. Целью изобретения является создание нового штамма гибридных клеток животных Mus musculus. секретирующего моноклональные антитела (МКА), специфически выявляющие N-энти- ген в эритроцитах и слабо реагирующие с эритроцитами, не имеющими этого антигена. Штамм получают слиянием мышиной миеломы РЗ-ХбЗ-А.8.653 с клетками селезенки мышей линии, BALB/c, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON, под воздействием полиэтилен гликоля М.В.3000 и дальнейшего культивирования в селективной среде ГАТ. Соотношение мие- ломных клеток и спленоцитов 1,:3. Секрети- руемые МКА в культуральной жидкости достигают титра 1:256 - 1:512, в асцитной жидкости 1:12800-1:25600; Штамм обозначен N-89/4 и депонирован под номером BCKK0I) Ж62Д. МКА могут быть использованы для выявления N-антигена в эритроцитах. 2 табл. Штамм перевиваемых гибридных клеток N-89/4 получают в результате слияния мышиной миеломы Р3-Х63-Ад.8.653 с клетками селезенки мышей линии ВАШ/с, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON, под воздействием полиэти- ленгликоля м.в. 3000 и дальнейшем культивировании в селективной среде ГАТ. При слиянии соотношение миеломных клеток и спленоцитов составляет ,1:3. После слияния клетки культивируют в 96-л у ночных платах из расчета 2х105спленоцитов/ячейку 96сл с ч - N VJ

10

Таблица 2