00 00
со
Изобретение относится к биотехно- логин и может бытьь использовано для изучения механизмов цитодифференци- ровки в норме и патологии.
Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирую- ,щего моноклональные антитела (МКА) к кератину № 17 человека,
Штамм получают следующим образом.
Фракцию промежуточных филаментов вьщеляют из толстой кишки крыс путем последовательной экстракции буфером низкой ионной силы (140 ral i NaCl) и буфером высокой ионной, силы (1,5 М КС1) в присутствии 1%-ного тритона Х100. Мьшей BALB/C иммунизируют общей дозой антигена 0,5 мг на мышь, Первая инъекция: внутрибрюшинно смес равных (по 0,2 мл) объемов антигена адъюванта Фрейнда. Последующие пять внутрибрюшинных инъекций проводят с рнтервалом в 10 дней с неполным адъI ювантом. Последнюю внутривенную инъ- екцию проводят за 4 суток до гибри- дизации. Далее 10 клеток селезенки ; иммунных мышей гибридизуют с 4x10 клеток миеломы X 63 - Ag 8.653 с по- мощью 45%-ного раствора полиэтилен- j гликоля с м.м. 1000, Культивирование I гибридных клеток проводят в 96-луноч I ных платах на питательном слое пери- 1 тонеальных макрофагов мьшей (10 гиб : ридных клеток на 10 макрофагов, вы- i сеянных накануне). Питательная среда i ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сы ; воротки, 10% лошадиной сыворотки, пируват (1мМ), 10 М гипоксантина, i 4 10 М аминоптерина и 1,6 10 М ; тимидина. Гибридомы клонируют 4 раза высевая по 1 клетке на лунку, содержащую 10 макрофагов. Отбор клонов осуществляют по иммунофлуоресцентно- му окрашиванию культуры клеток крыси ной гепатомы 27. Супернатант одного из 800 положительных кланов реагирует в реакции иммуноблоттинга с кератином № 17 человека.
Полученный штамм гибридных клеток обозначают ЕЗ. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером 135D и характеризуется следующи- ми признаками.
Культуральные признаки. Среда культивирования - среда Игла в модификации Дульбекко (ДМЕМ) с
Q
15 0 з5 : 40 , 45 „55
792
20% эмбриональной телячьей сьпифотки (или 10% эмбриональной телячье й сыворотки и 10% лошадиной сыворотки), 1 мМ глубамина, 100 ед. гентамицина в 1 мл.
Для выращивания штамма используют стеклянную или пластиковую посуду. Во флакон объемом 25 см в 5 мл среды засевают 2-5 х 10 клеток. Пассаж - 1 раз в 4-5 дней той же дозой клеток. Без подсчета клеток - 1:3. Клетки культивируют при З7 с в атмосфере 5%. СО. Культивирование гибридом возможно в мышах линии BALB/c.
Продуктивность штамма.
Секреция МКА на пятый день культи- дзирования составляет 5-10 мкг/мл. Стабильная секреция продукта сохраняется до 30 пассажей в культуре.
Кариологические признаки.
Модальное число хромосом - 51.
Характеристика полезного продукта.
МКА относятся к классу IgG 2b(H).
В реакции иммуноблоттинга с кератинами из культуры клеток HeLa и срезов органов человека МКА реагируют одной полосой с кератином м.м. 46KD (№ 17).
Контаминация.
бактерии и грибы в.культуре при длительном наблюдении и посевах на питательные среды не обнаружены.
Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в эмбриональной телячьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксида в концентрации 1-3x10 клеток в 1 мл, разливают в стерильные пластиковые ампулы при 4 и замораживают в жидком азоте по программе со снижением температуры на 1 С в минуту с последующим переносом в жидкий азот., Размораживание: 1 мин при 37°С.Клетки разводят в 5-10 мл полной среды, центрифугируют при комнатной температуре 5 мин при 1000 об/ /мин, сливают среду, заливают 10 мл свежей среды и переносят в лунки 24- луночной пластины с макрофагами. Жизнеспособность клеток по включению три- панового синего составляет 50-90%.
Пример. Использование штамма ЕЗ t
Кусочек ткани молочной железы, удаленной при биопсии не позже 1 ч после операции, заливают в 7%-ный раствор, желатины на забуференном физиологическом растворе (ЗФР) и замораживают в жидком, азоте. Срезы толщиной
1
5 мкм. яготовляют на криотомо. и фиксируют 4 мин в А%-ном растворе формалина на ЗФР. После отмывания в трех сменах ЗФР ставят реакцию непрямой иммунофлуоресценции при комнатной температуре. Первая инкубация - куль- туральная надосадочная жидкость гибридных клеток ЕЗ (30 мин), вторая инкубация - кроличья антисыворотка про- тив гамма-глобулинов мыши, меченная флуоресценизоцианатом в разведении 1:20 (30 мин). Инкубации перемежаются отмыванием в ЗФР. Перед заключением в глицерин (1: 1 на ЗФР) - окраска гематоксилином 10 с. Контроль - пер- вая инкубация ЗФР,
Препарат исследуют в микроскопе с флуоресцентной насадкой. В резуль- тате обнаруживают свечение базально расположенных миоэпителиальных клеток междолькового протока молочной железы человека, что свидетельствует о содержании в этих клетках кератина № 17. Клетки, выстилающие просвет протока, не окрашены и, следовательно, не содержат кератин № 17.
Дальнейшие исследования показывают, что в иммуноморфологических ре-
79.
акциях непрямой иммуиофлуоресцешиш МКЛ избирательно реагируют с белками промежуточных филаментов (кератинов) культивируемых клеток человека линии HeLa, но не реагируют с клетками НТ29 На крностатных резах из органов человека МКА избирательно реагируют с кератином базальных слоев клеток переходного эпителия мочевого пузыря, мкогорядного эпителия гортани, бронхов, трахеи, с клетками миоэпите- лия в железах: слюнных, потовых, молочных; железах подслизистой трахеи, бронхов, пищевода;с камбиальными клетками придатков эпидермиса - сальных желез и волосяных фолликулов. В реакции иммуноблоттинга с препаратами цитоскелета культивируемых клеток HeLa и слюнной железы человека антитела ЕЗ реагируют одной полосой с кератином м.м1 46 КД(№ 17).
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) № 135D, используемый для получения моноклональных антител к кератину № 17 человека.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изучения механизмов цитодиффереНци- ровки в норме и паталогии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток жи- вотних MUS musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к кератину № 17 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мьппей линии BALB/C, иммунизированных фракцией промежуточных филаментов, с клетками миеломы X 63-Ag 8.653. Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Секреция МКА на 5-й день культивирования составляет 5-10 мкг/мл. МКА относятся к классу IgG2b(H). В реакции иммуноблоттинга с кератинами из культуры клеток HeLa и срезов органов человека МКА реагируют одной полосой с кератином м.м. 46 КД(№ 17). ф (Л
