Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов человека Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 A61K39/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано дпя диагностики лейкозов и лимфом человека.

Целью изобретения является получение штамма гибридньк культивируе- Mbtx клеток животных Mus Musculus, продуцирующего моноклональные анти-. тепа (мл) к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов, характерному для

стадии антиген-зависимой дифференцировки.

Штамм ID7 получают следующим образом..

Мышей линии BALВ/с иммунизируют клеточной линией BALB/c-1788 6-лим- фоцитов периферической крови человека, трансформированных вирусом Эн- штейна-Барр.

При этом Mijiiuefi иммунизируют 3 раза внутрибрюшинно и 1 раз внутривенно (от 2,4 до 10, до 1540 клеток с интервалами 1 4, 4 и 4 недели)„ Через 4 дня после внутривеннорТ; иммунизации проводят соматическую гибридизацию с помощью 50% полиэтиленгли- холя м.м. 1500 клеток селезенки с клетками миеломы P3-X63--Ag 8,653. Клетки разливают в 96 луночные пластиковые плоскодонные планшеты. Для культивирования гибридных клеток на первых этапах .используют среду MEM в модификации Дальбекко с 5% лоша- диной сыворотки. После слияния в культуры клеток .в течение двух недел добавляют НАТ-сре.ду (конечная концентрация гипоксантина 10 М, аки ноптерина 4х10 м, тимидина 1,6x10 М) а затем в течение одной недели ИТ- среду.

После селекции гибридов в HAT- и НТ-средах рост клонов гибридом выявляют в 133 из 192 лунок. Скрининг специфической антительной активности проводят методом имг нофлуоресценции в непрямом варианте на монослое живы клеток. Клетки прикрепляют на предметные стекла,.обработанные раство- ром прли Ь лизина (lOO Mviri, м,м 40000-80000), При иммунофлуоресцент- ном анализе супернатантов гибридом специфическая антитепьная активность обнарул ена в 38 лунках, .а при клони- ровании способность синтезировать антитела к клеткам сохраняют 18.клонов гибридом. Клонирование методом лимитирующих разведений проводят 2 .раза с использованием пери- тонеальных макрофагов мышей ВА1,Б/с в качестве фидера. После рек.понирова ния и пассирования in vitro отбирают клон гибридом ID7, клетки которого активно продуцируют антитела к повер ностным антигенам клеток линии RPMI- 1788, Штамм ID7 хранится в Специализированной коллеки;ии перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером BCKK(n)76D и характеризуется следую- щими признаками.

Морфологические признаки. По ци- томорфологическим признакам клетки ID7 являются плазмобластами со средне-высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, базофильной цитоплазмой грубой структурой хроматина.

Культуральные признаки. Среда куль тивиронания - среда RPMI-1640 или MEM в модификации Дальбекко с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, мМЬ-глу- тамина, 100 мгк/мл гентамицина при . 37 С в атмосфере 5% СО , оптимум рН 6,8-7,5.

При росте на пластике клетки образуют плотный монослой. К стеклу клетки прикрепляются слабо и в стеклянных флаконах растут как в монослое, так и в суспензии. Посевная доза клеток 100 ТЫС.КЛ/М.П, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность, рассева 1:7.

Культивирование в организме живот- ньк. Для получения асцита пригодны лишь мьши BALB/C. Мышам за 7-30 дней до инъек1иш клеток вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5x10 клеток в 5 мл среды, асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 3-4-й день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 7,8 мкг/мл асцитной жидкости. Продукция liA сохраняется до 20 пассажей in vitro и до 3 пассажей на животных.

Биохимические признаки. В цитоплазме клеток не обнаружена активность ферментов пероксидазы и щелочной фосфатазы. .Активность кислой фос фатазы и кислой неспецифической эсте- разы в клетках гибридомы in vitro значительно ниже, чем в клетках, использованных для гибридизации, в то время как активность неспецифической эстеразы более выражена, чем в имму- нобласт.ах селезенки. Активность этих ферментов в гибридных клетках, культивируемых in vivOj очень слабая, практически отрицательная.Характеристика полезного продукта. Моноклональные антитела, секретируе- мые клетками штамма ID7, относятся к классу IgGI и выявляют дифференциро- вочный aHTnrj2H В-лимфоцитов человека на антиген-зависимой стадии дифферен- цировки.

Контаминация. При длительном наблюдении и посевах на питательные среды бактерии и грибы в культуре не обнаружены.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживаются в эмбриональной телячьей

5

сыворотке с добавлением 10% диметил- сульфоксида. Режим замораживания сле Г1УЮЩИЙ: °С в 1 мин до 4°С, затем Гс в 1 мин до -70°С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной баНе при 37 С, жизнеспособность клеток после размораживания 70-80% по окрашиванию трипановым синим.

Пример Методом иммунофлюо- ресценции исследуют специфичность МА на 11 линиях клеток человека, клетка 11 здоровых людей, 14 больных острым лимфобластным лейкозом, 8 больных лимфогранулематозом, 8 больных мие- ломной болезнью, клетках 10 миндалин детей с хроническим тонзиллитом и клетках периферической крови 10 здоровых лиц,бласттрансформйрованных в культуре in vitro митогеном лаконоса (PWM). Результаты исследования представлены в табл,1 и 2.

Результаты, приведенные в табл.1

и 2, свидетельствуют о том, что полученные МА являются Б-специфически- ми и не реагируют с Т-клеточными линиями линией К-562, антигенами моно- нуклеаров и гранулоцитов периферической крови здоровых людей, клетками костного мозга. Б то же время у 3 из 8 больньЕс лимфогранулематозом число клеток, связывающихся с антителами, достигает 18,0-49,0% и антитела мо892846

гут быть рекоме1щованы для диагностики лимфоидных форм лейкозов и лимфом. Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) № 76D, используемый для получения мо- ноклональных антител к дифференцйро- вочному антигену Б-лимфоцитов челове- 10 ка.

Таблица 1

Взаимодействие МА с клетками раз™ личных линий (число положительных

клеток, %) 15 1

Линии клеток

I Число положи- I тельных клеток

Б- клеточные линии:

RPMI-1788 751,2

PHS43,8

GRO34,5

Daudi66,7

Namalva24,0

Raji34,0

Ramos О

Т-клеточные линии:

Mol t-4О

CCRF-HSB2О

JurkatО

Ни-Т, ни-В-клеточная

линия:

К-562О

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики лейкозов и лимфом человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus muskulus, продуцирующего моноклональные антитела (НА) к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов, характерному для стадии антиген-зависимой дифферен- цировки. Штамм ID7 получают гибридизацией спленоцитов мьпией BALB/C, иммунизированных клеточной- линией RPMI-1788, с клетками миеломы РЗ-ХбЗ- Ag 8.653. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 76 D и характеризз -ется следующими признаками. Среда культивирования - среда RPMI-1640 или MEM - в модификации Дальбекко с 10% эмбриональной телячьей сьшоротки, посевная доза клеток - 100 тыс.кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:7. Секреция .моноклональных антител на 3-4 день культивирования составляет t5-20 мкг/мл культураль- ной среды и 7,8 мкг/мл .асцитической жидкости. Ж относятся к классу IgGI и выявляют дифференцировочный антиген В-лимфоцитов человека на антиген-зависимой стадии дифференцировки. МА используются для диагностики ликфо- цдных форм лейкозов и лимфом, 2 табл. i 00

Таблица 2

Взаимодействие МА с клетками крови в норме и при злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях

Клетки здоровых людей: мононуклеары периферической крови гранулоциты крови . клетки костного мозга

Мононуклеары периферической крови после стимуляции PWM

Клетки миндалин детей при хроническом тонзиллите

0-1,0

О

1-1,5

7,5-34,0 8,0-10,0

Продолжение табл,2

I

2/138,0-14,6

2/165,7-10,0 1/8 . 16,5

3/818,0-49,0