Способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека в крови Советский патент 1990 года по МПК G01N33/535 

Изобретет1е относится к медицине, ,а именно к иммунодиагностике синдрома приобретенного иммунодефицита, и может быть использопано для определения наличия в сыворотке крови человека антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ).

Целью изобрет.ения является увеличение чувствительности и упрощение способа определения антител к ВИЧ.

ошД.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят эЛктрофорез вируссодер- жащего материала (экстрактов вирус- , продуцирующих клеток лимфоблостоидной линии НТА-4 ) в акриламидном градиентном 4-20%-ном геле с детергентом. Осуществляют электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану, иден- Q тифицируют их, монтируют диагностическую полоску, проводят взаимодействие -с исследуемой пробой, а связавшиеся специфические антитела выявляют, используя параллельно два маркер- j

ляют смесь на 1 ч при постоянном пе мешивании. Смесь центрифугируют при 20000g 1 ч. Осадок отбрасывают, суп натант диализуют против ЗФР 18 ч. П ле диализа полученный экстракт виру продуцируюш 1х клеток замораживают и хранят при -20 С или лиофилизируют хранят при АС.

1,2. Проведение электрофореза бе ков БИЧ,, полученных из экстракта ви рус-продуцирующих клеток в акрилами ном геле. Электрофорез проводят в г ле толщиной.1,5 мм, размером 60 х X 160 мм с использованием 4%-ного

20

25

ных фермента: уз-лактамазу из Bacillus licheniformis 749/С и перексид а- зу хрена.

Пример 1. 1.1. Получение экстракта белков ВИЧ из вирус-про- дуцирующих клеток.

1 л культуры вирус-продуцируюш 1х клеток (лимфоблостоидная линия НТА-4) центрифугируют при 2000g, 30 мин при охлаждении. Осадок, со- держаш 1й вирус-продуцирующие .клетки, используют для получения экстракта. При использовании только очищенного вирусного препарата из 1 л вирус- . продуцирующей культуры можно получить 2Q до 3500 диагностических доз (при проведении определения методом твердофазного иммуноферментного анализа). Возможность использования осадка для получения антигенов (ВИЧ позволяет подучить дополнительно еще до 1500 доз (при проведении определения предлагаемым способом), т.е. выход увеличивается на 30%.

Таким образом, возможность использования осадка повьш ает экономичность метода.

О садок суспендируют в 0,9%-ном растворе NaCl в 0,1 М Na-фосфатном . буфере (ЗФР),, рН 7,0. Медленно, при перемешивании, добавляют равный обьем 96%-ного этилового спирта к суспензии вирус-продуцирующих клеток в ЗФР. Операцию проводят при охлаждении, температура суспензии не

концентрирующего акриламидного геля рН 6,8 и градиентного 4-20%-ного ра деляющего геля, рН 8,8. Оба геля со держат додецилсульфат Na(SDS) 0,1%

Приготовление растворов для пров дения электрофореза.

Электродньш буфер: 45 г триса, 216 г глицина, 15 г SDS, 3 л в.оды, рН 8,3. Перед проведением электрофо реза электродный буфер разводят водой 1 :5.

Концентрирующий гель: 6,1 мл вод 2,5 мл 0,5 М трис-НС буфера рН 6,8 100 мкл 10%-ного SDS, 1,3 мл акрил- амида из 30%-ного раствора акрилами да, содержащего 0,8% бисакриламида. 50 мкл 10%-ного свежеприготовленног персульфата аммония, 10 мкл ТЕМЕД (N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин).

4%-ный разделяющий гель: 10,22 м воды, 4,25 мл 1,5 М три-НС1 буфера , 8,8 0,17 мл 10%-ного SDS, 2,3 мл 30%-ного акриламида, содержащего 0,8% бисакриламида, 0,085 мл 10%-но персульфата, аммония, 8,5 мкл ТЕМЕД 20%-ный радзделяющий гель: 1 мл воды, 3,75 мл 1,5 М трис-НС1 буфера рН 8,8, 0,15 мл 10%-ного SDS, 10мл 30%-ного акриламида, содержащего 0,8% бисакриламида, 75 мкл 10%-ног 5 персульфата аммония, 7,5 мкл ТЕМЕД Раствор для образцов, 4 мп воды 1 мл 0,5 М трис-НС буфера рН ,6,8 0,8 МП глицерина, 1,6 мл 10%-ного SDS, 0,4 мл 2-р меркаптоэтанола.

35

40

дении, температура 1;усиспзии л. ,..--- /-

должна быть вьше . Смесь бтстаива-50 0,2 мл 0,05%-ногО бромфенолового ют .30 мин при комнатной температуре, синего. Исследуемое вещество раст- а затем центрифугируют при 2000g 30 мин. Осадок собирают, гомогенизируют 15 мин в стеклянном гомогенизаторе в 0, растворе дезоксихола- 55 та, а затем добавляют н-октилглюкози- да до концентрации 0,4% и снова, гомо- (Тенизируют 15 мин, посЛе чего i

воряют в растворе для образцов и п гревают 5 мин на кипящей водяной бане.

Заливка градиентного геля.

В первый сосуд прибора для град ентной заливки геля помещают приго товленный раствор 20%-ного акрилам

ляют смесь на 1 ч при постоянном перемешивании. Смесь центрифугируют при 20000g 1 ч. Осадок отбрасывают, супер- натант диализуют против ЗФР 18 ч. После диализа полученный экстракт вирус- продуцируюш 1х клеток замораживают и хранят при -20 С или лиофилизируют и хранят при АС.

1,2. Проведение электрофореза белков БИЧ,, полученных из экстракта ви- рус-продуцирующих клеток в акриламидном геле. Электрофорез проводят в геле толщиной.1,5 мм, размером 60 х X 160 мм с использованием 4%-ного

Q

0

5

2Q концентрирующего акриламидного геля, рН 6,8 и градиентного 4-20%-ного разделяющего геля, рН 8,8. Оба геля содержат додецилсульфат Na(SDS) 0,1%:

Приготовление растворов для проведения электрофореза.

Электродньш буфер: 45 г триса, 216 г глицина, 15 г SDS, 3 л в.оды, рН 8,3. Перед проведением электрофореза электродный буфер разводят водой 1 :5. ;

Концентрирующий гель: 6,1 мл воды, 2,5 мл 0,5 М трис-НС буфера рН 6,8, 100 мкл 10%-ного SDS, 1,3 мл акрил- амида из 30%-ного раствора акрилами- да, содержащего 0,8% бисакриламида. 50 мкл 10%-ного свежеприготовленного персульфата аммония, 10 мкл ТЕМЕД (N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин).

4%-ный разделяющий гель: 10,22 мл воды, 4,25 мл 1,5 М три-НС1 буфера рН , 8,8 0,17 мл 10%-ного SDS, 2,3 мл 30%-ного акриламида, содержащего 0,8% бисакриламида, 0,085 мл 10%-ного персульфата, аммония, 8,5 мкл ТЕМЕД. 20%-ный радзделяющий гель: 1 мл воды, 3,75 мл 1,5 М трис-НС1 буфера, рН 8,8, 0,15 мл 10%-ного SDS, 10мл 30%-ного акриламида, содержащего 0,8% бисакриламида, 75 мкл 10%-ного , 5 персульфата аммония, 7,5 мкл ТЕМЕД.. Раствор для образцов, 4 мп воды, 1 мл 0,5 М трис-НС буфера рН ,6,8, 0,8 МП глицерина, 1,6 мл 10%-ного SDS, 0,4 мл 2-р меркаптоэтанола.

35

40

,..--- /-

-50 0,2 мл 0,05%-ногО бромфенолового синего. Исследуемое вещество раст- 55 i

0,2 мл 0,05%-ногО бромфенолового синего. Исследуемое вещество раст-

воряют в растворе для образцов и прогревают 5 мин на кипящей водяной бане.

Заливка градиентного геля.

В первый сосуд прибора для градиентной заливки геля помещают приготовленный раствор 20%-ного акрилами 5..

него геля, во второй сосуд помешают раствор 4%-ного акриламидного геля Заливку осуществляют так, чтобы высота градиентного геля составила не менее 120 мм.

Заливка концентрирующего геля. После заливки концентрирующего г ля до полимеризации геля в раствор помещают греРенку для электрофореза . После полимеризации геля гребенку удаляют.

Планшет с заполимеризованным акр ламидным гелем помещают в прибор для электрофореза фирмы Bio-Rad Protean// Slab Cell или.в любой аналогичный прибор для проведения вертикального электрофореза в пластинах. I

Образец экстракта вирус-продуци- рующих клеток помещают в раствор дл образцов и проводят операции согласно п. 1.2. На 160 мм ширины геля необходимо нанести не более 1,6 мг белка экстракта вирус-продуцирую- щих клеток. Кроме экстракта вирус- продуцируюших клеток на одну из дорожек наносят смесь маркерных белков различной молекулярной массы.

Режим проведения электрофореза.

25 мА на гель для прохождения концентрирующего геля, 7-8 мА на гель для прохождения разделяющего геля. Общее время проведения электрофореза 20 ч.

1,3, Проведение электропереноса белков ВИЧ, полученных из экстракта вирус-продуцирующих клеток на нитро- целлюлозный фильтр.

Буфер для проведения электропереноса:

7,57 -г триса, 36 г глицирина, 0,5 л 96%-ного этилового спирта, воды до суммарного объема 2,5 л, рН 8,3.

Нитроцеллюлозньй фильтр, вымоченный в буфере для электропереноса, накладывают на а криламидный гель, в котором проведан электрофорез белков экстракта вирус-продуцирующих клеток. На нитроцеллюлозный фильтр и на обратную сторону акриламидного геля накладывают прокладки из фильтровальной бумаги, смоченные буфером для электропереноса. Полученный блок акриламидный. гель - нитроцеллюлозный фильтр - прокладки помещают в прибор для электропереноса, заполненный буфером для электропереноса,

to

15

97728«4

Электроперенос осуществляется при напряжении 100 В 2 ч при охлаждении прибора.

1,4. .Идентификация белков ВИЧ на 5 нитроцеллюлозном фильтре.

Для определения места расположения маркерных белков различных молекулярных масс после электропереноса белков нитроцеллюлозньй фильтр окрашивают 30 мин 1%-ным раствором амидочерного, а затем отмывают избыток красителя ЗФР с 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т).

С целью точного определения мест расположения белков ВИЧ различной молекулярной массы, строят калибровочный график зависимости Ig молекулярной массы от длины пробега белков на 20 электрофорезе. Перед иммунофермент- ной индентификацией нитроцеллюлозный фильтр инкубируют в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина 1 ч для инактивации оставшихся сво бодны- 25 ми центров связывания белков на нитроцеллюлозе. С двух противоположньгх сторон нитроцелл олозного фильтра вдоль направления электрофореза отрезают две полоски пшриной 2-3 мм .JQ и помещают их на 1 ч в разведенную 1:100 ЗФР-Т с 1%-ным бычьим сывороточным альбумином пуллированную человеческую сыворотку, содержащую антитела ко всем белкам ВИЧ, Полоски отмывают ЗФР-Т 3 раза по 2-3 мин, зё.- 5 тем отмывают 5 раз водой. Полоски помещают в раствор конъюгата кроли-. чьих антител к иммуноглобулинам человека (RAH) с пероксидазой хрена на 1 ч. Проводят отмывку в ЗФР-Т

40

3 раза и затем водой.

Полоски помещают в раствор субстрата для пероксидазы: 0,05%-ный раствор диаминобензидина, который содержит -10 мкл на 100 мл раствора. Через -2-5 мин инкубации, в тех местах, где локализованы белки .ВИЧ, появляются полосы кирпично-красного цвета.

1.5. Монтаж диагностической полоски.

После определения локали зации белков ВИЧ иммуноферментным методом и по молекулярным массам из пластин нитроцеллюяозного фильтра вырезают полоски, соответствующие белкам gp120, gp4l, р5 5, р24, так, чтобы место расположения белка на нитроцеллюлозе

находилось посредине вьфезаннои полоски.

На специальную бумажную ручку с нанесением на нее цифрами 1,2,3,4 нит- роцеллюлозным клеем монтируются фрагменты нитроцеллюлозных фильтров, содержащие белки ВИЧ, так, что напротив цифры 1 находится белок gp120, 2-gp41, 3-р55, 4-р24, Размеры фрагментов р 8 х5 мм.

Для придания ручке механической жесткости она заклеивается прозрачной липкой лентой, при этом фрагменты нитроцеллюлозных фильт.ров остают- jj СИ свободными (их размеры 5X5 мм) и образуют активную часть диагностической полоски.

1.6. Использование диагностической полоски.20

Активную часть диагностической полоски погружают в раствор исследуемой сыворотки, разведенной в соотношении 1:100 ЗФР-Т на-40 мин. В каждую из испытуемых сывороток погружа- 25 ют две диагностические полоски.

Диагностическую полоску отмывают 3 раза ЗФР-Т и водой 5. раз. По одной диагностической полоске, проинкубированной в каждой из испытуемых сыво- дО роток, помеп(ают в конъюгат RAH, меченный пе роксИдазой хрена, а по одной - в конъюгат RAH, меченный уз-лак- тамазой из Bacillus licheniformis 749/С. С обоими конъюгатами инкубацию проводят 40 мин. Повторяют отмывку. Диагностическую полоску, инкубировавшуюся в конъюгате кроличьих антител против глобулинов человека (КАГ), меченном пероксидазой, помещают в раствор диаминобензидина. Если в испытуемой сыворотке присутствуют антитела к белкам ВИЧ, то на ак-. тивной части диагностической полоски д появятся кирпично-красные полосы, если антитела к белкам ВИЧ отсутству-- . ют - активная часть останется неок- . рашенной.

15977288

антитела к белкам ВИЧ отсутствуют - реагент остается синим.

Пример2. Дифференцирование положительной, т.е. содержащей антитела к белкам вируса ВИЧ, слабоположительной

т.е. содержащей ми35

40

нимальное количество антител, и псев доположительной сывороток при помощи диагностических полосок.

2.1.Проведение всех операций согласно примеру 1 до инкубации с КАГ включительно.

2.2.Диагностическую полоску, инкубировавшуюся в конъюгат КАГ, меченном лактамазой, помещают в пробирку, содержащую 1 мл иодинола, разведенного 1:3 ЗФР и содержащего 0,1 мг бензилпенициллина на 1 мл. Синяя окраска раствора исчезает, если в исследуемой сыворотке содержались антитела к белкам ВИЧ.

2.3. Положительной можно считать такую сыворотку, которая при проведении операции, описанной в п. 1,6, дает окрашенные полосы на активной части диагностической полоски, при проведении операции п. 1.6 раствор пенициллина в иодиноле обесцвечивается.

2.4. Слабоположительной можно считать сыворотку, дающую положительный ответ только с конъюгатом КАГ, ме ченным й-лактамазой .

В случае слабоположительной сыворотки при использовании пероксидаз- ного конъюгата вследствие незначитель ного количества присутствующих в ней антител к белкам ВИЧ может не наблюдаться видимых визуально полос на фрагментах нитроцеллюлозного фильтра (или эти полосы могут быть видны слабо), однако при использовании /Ь-лактамазы в качестве маркера суммируется ферментативная активность молекул иммуноферментного конъюгата, специфически сербированных на фрагментах нитроцеллюлозного фильтра, составляющих диагностическую полоску, что в совокупности с более высокой удельной активностью л-лактамазы позволяет отличать слабоположительные сыворотки от отрицательных. В этом случае можно-установить только факт наличия антител и невозможно установить, к каким именно белкам ВИЧ имеются антитела.

Диагностическую полоску, ииГкуби- ровавшуюся в конъюгате, меченном лак- тамазой, помещают в 2 мл йодного реагента - раствор иодинола, разведенный ЗФР в соотношении 1:3, содержащий 0,1 мг/мл бензилпенициллина. Ее ли в испытуемой сыворотке присутствуют антитела к белкам ВИЧ, то синий йодный реагент обесцвечивается, е.сли

положительной

т.е. содержащей ми- , р

jj

20

25

дОд

35

40

-

50

55

нимальное количество антител, и псевдоположительной сывороток при помощи диагностических полосок.

2.1.Проведение всех операций согласно примеру 1 до инкубации с КАГ включительно.

2.2.Диагностическую полоску, инкубировавшуюся в конъюгат КАГ, меченном лактамазой, помещают в пробирку, содержащую 1 мл иодинола, разведенного 1:3 ЗФР и содержащего 0,1 мг бензилпенициллина на 1 мл. Синяя окраска раствора исчезает, если в исследуемой сыворотке содержались антитела к белкам ВИЧ.

2.3. Положительной можно считать такую сыворотку, которая при проведении операции, описанной в п. 1,6, дает окрашенные полосы на активной части диагностической полоски, при проведении операции п. 1.6 раствор пенициллина в иодиноле обесцвечивается.

2.4. Слабоположительной можно считать сыворотку, дающую положительный ответ только с конъюгатом КАГ, меченным й-лактамазой .

В случае слабоположительной сыворотки при использовании пероксидаз- ного конъюгата вследствие незначительного количества присутствующих в ней антител к белкам ВИЧ может не наблюдаться видимых визуально полос на фрагментах нитроцеллюлозного фильтра (или эти полосы могут быть видны слабо), однако при использовании /Ь-лактамазы в качестве маркера суммируется ферментативная активность молекул иммуноферментного конъюгата, специфически сербированных на фрагментах нитроцеллюлозного фильтра, составляющих диагностическую полоску, что в совокупности с более высокой удельной активностью л-лактамазы позволяет отличать слабоположительные сыворотки от отрицательных. В этом случае можно-установить только факт наличия антител и невозможно установить, к каким именно белкам ВИЧ имеются антитела.

2.5. Псевдоположительной можно считать сыворотку, которая при проведении-операции 1,6. дает oKpainenную полосу, соответствующую белку р24, также дающую положительный ответ..

Применение двух маркерных ферментов, различных по своей удельной активности (уй-лактамаза из Bacillus Hcheniforrais 749/С превосходит . пероксидазу хрена по удельной активности - числу оборотов в 100 раз) позволяет выявить слабоположительные сыворотки и различать псевдо- положи тельные, т.е. имеющие антитела только к р2А, от положительных

т.е. имеющих антитела к нескольким белкам ВИЧ..

Таким образом, предлагаемый способ дает возможность увеличить чувствительность определения, упростить интерпретацию результатов и повысить их достоверность. Кроме того, предлагаемый способ более экономичен, чем прототип.

Формула изобретен, и я

Способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека в крови при помощи иммуноферментного метода с ис59772Я ° .

пользованием маркерных белков вируса иммунодефицита человека, получаемых из вирУссодержащего материала методом электрофореза в акриламидном геле, электропереноса их на нитроцеллюяоз- ную мембрану с последующей идентификацией, добавлением исследуемой пробы, выявлением специфических антител конъюгатом кроличьих иммуноглобулинов против иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, в качестве вируссодержащего материала используют экстракт вирус- продуцирующих клеток, электрофорез проводят в градиентном акриламидном

to

15

геле, идентификацию белков вируса 20 иммунодефицита человека осуществляют ;путем монтирования фрагментов нитроцеллюлозной мембраны с маркерными белками в диагностическую полоску, а для выявления специфических 25 антител дополнительно добавляют конъю- гаты кроличьих иммуноглобулинов против иммуноглобулинов человека с р-лактамазой из Bacillus licheni- formis 749/С. ,

Изобретение относится к области медицины, конкретно к иммунодиагностике синдрома приобретенного иммунодефицита, и может быть использовано для определения наличия антител к белкам вируса ВИЧ в крови. Цель - повышение чувствительности и упрощение способа. В предлагаемом способе определения антител к белкам ВИЧ применяют SDS-электрофорез в градиентном 4-20%-ном акриламидном геле, вируссодержащий материал - экстракты вируспродуцирующих клеток лимфобластоидной линии НТА-4. Разделенные в акриламидном геле до индивидуальных белковых полос антигены ВИЧ переносят методом электропереноса на нитроцеллюлозный фильтр, вирусные антигены идентифицируют и полосы нитроцеллюлозных фильтров, соответствующие белкам р24, р55, др 41, др 120, вырезают и фрагменты этих полос монтируют нитроцеллюлозным клеем на специальную бумажную пластинку, формируя Диагностическую полоску. Активную часть Диагностической полоски, представляющую собой 4 фрагмента нитроцеллюлозных фильтров, каждый из которых несет на своей поверхности один белок ВИЧ : р24, р55, др 41, др 120, погружают в анализируемую сыворотку, разведенную 1:50 физиологическим раствором. После инкубации Диагностическую полоску проявляют с использованием антивидового конъюгата, аналогично иммунологическому проявлению способа - прототипа - Вестернблот. Для повышение достоверности результатов анализа при иммуноферментном определении используют два маркерных фермента - β - лактамазу из BACILLUS LICHENIFORMIS и пероксидазу хрена.