Штамм дрожжей RноDотоRULа RUвRа (Dемме) LoDDeR, используемый в качестве тест-организма для выявления и оценки действия гиполипидемических средств Советский патент 1992 года по МПК C12P17/06 A61K31/44 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской отраслям промышленности и представляет собой новый штамм дрожжей, используемый в качестве тест-организма для выявления и оценки действия гиполипидемических средств.

Основным методом, используемым в настоящее время для определения действия гиполипидемических факторов, является включение 14с -ацетата в 14 холестерин интактными клетками фибропластов кожи человека. Культуру фибропластов получают биопсией из кожи нормальных людей, растят в виде монослоя и используют между 5-20 пассажами. Культуру клеток поддерживают и выращивают в специальном увлажненном СОг-инкубаторе, в специальных флаконах на среде Игла с добавлением антибиотиков, аминокислот и телячьей сыворотки. Монослои фибропластов после нескольких пассажей инкубируют с 34с}- ацетатом в среде А, содержащей 10%-ный липопротеин - дефицитной сыворотки. 14с -холестерин экстрагируют из клеток петролейным эфиром, проводят тонкослойную хроматографию и определяют 14chxo- лестерин в расчете на МГ белка. Недостатки данного метода:

длительность определения ингибитор- ной активности (9-11 сут);

использование дорогостоящих импортных реактивов и сред;

4J

о ел со

ь

о

необходимость использования специального импортного оборудования (специальные флаконы, СОа-инкубатор, микроскоп инвертированный).

Существует также способ определения и оценки активности ингибиторов синтеза холестерина в бесклеточных экстрактах животных клеток. Сущность метода заключает- ся в определении способности гиполипидемических факторов ингибиро- вать активность ключевого фермента начальных этапов синтеза холестерина

3-гидрокси 3-метилглутарил КоА-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы). Определение проводят в реакционной смеси, содержащей DL- 14С-3-гидрокси 3-метилглутарил-КоА, К-фосфатный буфер рН 7,4, ЭДТА, дитиот- риэтол, НАДФН и микросомальный белок. Смесь инкубируют при 37°С 30 мин, проводят тонкослойную хроматографию на пла- стинках F-254 (Merck) и на хроматограмме определяют радиоактивность лактона мева- лоновой кислоты.

Недостатки способа:

сложность и длительность получения микросомэльного белка из клеток животных;

использование дорогостоящих импортных реактивов (DL- С-ГМГ-КоА, пластинки F-254 производства фирмы Merck);

наличие специального импортного оборудования (скоростные центрифуги, счетчики радиоактивности).

Наиболее близким по достигаемому результату к предлагаемому штамму является метод, по которому добавляют в специальную питательную среду 0,1-2% мкг/мл ком- пактина или его аналогов, ингибирует рост

4-х штаммов дрожжей: Rhodotorula glutinls Н 3-9-1, Sporobolomyces salmonlcolor WF 188, Aessosporon salmonicolor IFO 1845, Clteromyces matritensls IFO 0095 U.

Недостатки метода:

высокая минимальная ингибирующая концентрация компактина (0,1 мкг в мл);

длительность культивирования дрожжей с компактином для достижения эффекта ингибирования (4 сут).

Целью изобретения является штамм дрожжей высокочувствительный к гиполи- пидемическим лекарственным препаратам и используемый для определения наличия и оценки эффективности новых ингибиторов биосинтеза изопреноидов, в том числе холе- стерина.

Предлагаемый штамм выделен на кафедре биологии почв МГУ им. М.В.Ломоносова из ризосферы сахарной свеклы на дерново-подзолистой окультуренной почве

и определен как Rhodotorula rubra (Demme) Lodder ВКПМ-У-1337 (438). Штамм депонирован в ВКПМ под коллекционным номером У/-1337.

Характеристика штамма. Морфологические, культуральные и физиологические особенности.

Рост в жидком сусле. Через 5 сут при 2б°С в среде слабая муть, небольшой розовый осадок и тонкое розовое пристеночное кольцо. Клетки в жидкости овальные, удлиненные, одиночные с полярными почками, образуют конгломераты, пучки, Размеры (2,0-5,5)х(4,5-12.0) мкм. Встречаются длинные нити псевдомицелия, которые слагают кольцо. Длина клеток псевдомицелия до 15 мкм и более. Через месяц кольцо хорошо выражено и обильный осадок.

Рост на сусло-агаре. Морфология клеток сходна с описанной выше, но псевдомице- лиальные структуры преобладают. При рассеве штамм расщепляется на гладкий и складчатый варианты. Колонии складчатого варианта вновь выщепляют гладкие, которые со временем приобретают складчатый фенотип. Почти все клетки собраны в нити псевдомицелия. Брожение: отсутствует.

Ассимиляция источников углерода: утилизирует D-глюкозу. D-галактозу, L-сорбо- зу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу, салицин, арбутин, раффинозу, мелецитозу, инулин, сорбит, маннит, 2-ке- тоглютонат. янтарную, лимонную, яблочную кислоты. Слабо утилизирует: L-рибозу, D- арабинозу, L-рамнозу, Ьметил-О-глюкозид, глицерин, рибит, этанол. Не утилизирует: D-ксилозу, L-арабинозу, мелибиозу, лактозу, крахмал, эритрит, дульцит, инозит, 5-ке- то-глюконат, глюкуроновую и молочную кислоты.

Ассимиляция нитратов: не ассимилирует.

В среде без витаминов не растет, нуждается в тиамине (Bi).

Рост при 37°С: отсутствует.

Образование крахмала: нет.

Расщепление арбутина: есть.

Уреазная активность: присутствует.

Проведение испытаний чувствительности различных видов дрожжей к одному из эффективных лечебных гиполипидемических препаратов - ловастатину, показало, что рост предлагаемого штамма Rhodotorula rubra ВКПМ Y-1337 (438)ингибируется лова- статином в концентрации 0,05 мкг/мл через 20 ч от начала испытаний (табл. 1). В то же время штаммы прототипа чувствительны к ловастатину в концентрациях 0.1-2,0 мкг/мл и ингибирующий эффект достигается через 96 ч культивирования.

Данные табл. 1 показывают, что преимуществами предлагаемого штамма по сравнению со штаммами прототипа является, во-первых, более низкая минимальная ингибирующая концентрация (0,05-0,2 мкг/мл) против 0,1-1,0 мкг/мл в прототипе) и меньшее время достижения ингибирую- щего эффекта (20 вместо 96 часов в прототипе).

Приведенные характеристики штамма позволяют использовать его в качестве тест-организма при определении ингибиру- ющей активности гиполипидемических средств в биологических жидкостях и в чистых препаратах. Кроме того, предлагаемый штамм может быть использован при изыскании новых лекарственных средств для лечения атеросклероза, в частности, таких, как ингибиторы синтеза холестерина: лова- статин, компактин и их аналоги и др.

П р и м е р 1. Посевной материал Rhodotorula rubra ВКПМ Y-1337 (438) выращивают на скошенной среде, содержащей 0,67% Bacto yeast nitrogen base фирмы Dlfco, 0,5% глюкозы и 1,5% агар-агара, рН 5,3 при комнатной температуре в течение 48 ч.

Клетки смь/вают стерильной жидкой средой описанного состава и вносят в опытные среды того же состава из расчета 1 10 кл/мл. Выращивание проводят глубинным способом, на качалке, при 25°С. В опытные варианты вносят 0,05 мкг/мл ловастатина в форме Na соли соответствующей оксикисло- ты. Ингибирование роста клеток ловастати- ном оценивают по оптической плотности при 610 нм по сравнению с контролем (рост дрожжей без ловастатина).

Как показано в табл. 2 0,05 мкг/мл является минимальной ингибирующей концент- рацией ловастатина для Rhodotorula rubra ВКПМ Y-1337. Эффект ингибирования отмечается уже через 16-20 ч от начала культивирования дрожжей с ловастатином и прослеживается вплоть до 40 ч.

П р и м е р 2.

Подготовку посевного материала и культивирование Rhodotorula rubra ВКПМ Y- 1337 (438) проводят также, как в примере 1. Отличие заключается в том. что ловастатин в опытные варианты вносят в количестве 0,1 мкг/мл,

Данные табл. 2 показывают, что повышение концентрации ловастатина увеличивает его ингибирующий эффект на рост предлагаемого штамма на протяжении всего периода наблюдаемого времени.

П р и м е р 3.

Подготовку посевного материала и культивирование штамма Rhodotorula rubra ВКПМ Y-1337 (438) проводят также, как и в примере 1. Отличие заключается в том. что ловастатин в опытные варианты вносят в концентрации 0,5 мкг/мл. Пятикратное увеличение гиполипидемического фактора усиливает торможение роста тест-обьекта, при этом прирост количества дрожжей отсутствует после 20 ч инкубации (табл. 2).

П р и м е р 4.

Подготовку посевного материала и культивирование Rhodotorula rubra ВКПМ Y- 1337 (438) проводят также, как в примере 1. Отличие заключается в том, что ловастатин в опытные варианты вносят в концентрации 2,0 мкг/мл. Высокие концентрации ловастатина (в частности 2,0 мкг/мл) приводят к 50%-ному торможению роста штамма тест- организма. Прирост количества дрожжей практически отсутствует после 16 ч инкубации (табл. 2).

Формула изобретения

Штамм дрожжей Rhodotorula rubra (Demme) Lodder В КПМ Y-1337 (438), используемый в качестве тест-организма для выявления и оценки действия гиполипидемических средств.

Изобретение относится к мэкробиоло- гической и медицинской отраслям промыш- ленности и касается штамма, используемого в качестве тест-организма для выявления и оценки действия гиполипи- демических лечебных средств. Целью изобретения является получение штамма дрожжей, высокочувствительного к гиполи- пидемическим лекарственным препаратам и используемого для определения наличия и оценки эффективности ингибиторов биосинтеза иэопреноидов, в том числе холестерина. Получен штамм Rhodotorula rub га ВКПМ Ґ-1337(438), рост которого подавляется в присутствии ловастатина в концентрациях 0,05-2,0 мкг/мл за 20 ч. что позволяет определять ингибиторы синтеза изопреноидов в биологических жидкостях и чистых препаратах. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика 8.02.90 г. под номером ВКЛМ Y-1337. 2 табл. ел с

Таблица 1

Чувствительность предлагаемого штамма и штаммов прототипа к гиполипидемическим

факторам.

Ингибировэние роста Rhodotorula rubra ВКПМ Y - 1337 (438) ловастатином в различных концентрациях.

Таблица 2