Способ определения гаптенов Советский патент 1988 года по МПК A61K39/385 G01N33/534 

ОС ОС

00

Изобретение относится к медицинской биохимии, а имем11о к способу определения гаитенов, и может быть использовано при диагностике различных патологических и физиологических состояний организма человека и животных, а также в научных исследованиях и биотехнологических процессах (например, получение стероидов с помощью ферментативных реакторов) при определении микроколичеств биологически активных ве- щеЬ в в жидкостях, не содержащих значи- тел|ьных количеств иммуноглобулинов группы G.

Цель изобретения - упрощение определения гаитена и сокращение времени ана- .чиЗа.

Пример I. Определение количества Stau- геи$, необходимого для выполнения радио- им 1у11о, 1О1 ическ01ч:) анализа прО1 естсрона. Все определения дублируются.

,обавляют в пробирки раствори реагентов-:

буфер / (0,15Л NaCI, 1 м.П ЭДТЛ, 50 фо(|фат11ый буфер, (),,| a. j. р11 7,4) (),Пмл; ,)-прогсчмч рои 0.1 м,. иу.1евой стандарт (6yi)ep А или ие содер- жа|цее прогестерона Kopoiii.e мо.юко, разведенное ДИСТИЛЛИрО1и1НН()Г| ВОД()11 в СПОТНО1нении 1:5) €,1 мл: а1Г|-ис1 1воротка кролика против кснгьюгата прогестерона бычш сывороточный альбумин (БСА) в разведонпп, , 1.пмом для связывания 40бО ;,)

вносимого ,1-11рогесте|)Она, 0,1 мл;

суспензия клеток St. anreus в буфе))е В (0,3% ТВИЫ-20, 0,4% холат, 0,15 М .аС1, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ фосфатный буфер, 0,02% NaN. j, рН 7,4), содержанхая 0,001: 0,005; 0,01; 0,005; 0,5; 0,75; 1 илп 5 мг бактериальных клеток в 0,1 мл, 0,1 мл.

:В нробирки для определения песпецифи- ческого связывания вместо антис141воротки добавляют буфер А.

Содержимое всех нробирок тнштельно перемешивают, и пробирки инкубируют 4 ч при комнатной температуре. После инкуба- ции пробирки центрифугируют 15 мин 2000 g, промывают осадки один раз 0,5 мл буфера В. Все пробирки с осадками помещают в га.м- ма-счетчик и измеряют количество импульсов в каждой пробирке в течение 1 мин. Рассчитывают среднее арифметическое значение (х) количества импульсов для каждой пары пробирок.

Определяют величину В/Т-100% для каждой дозы иммуносорбента, где В - связанная радиоактивность, имп/мин; Т - общая радиоактивность, имп/мин.

В линейных координатах строят график заЕшсимости В/Т-100% от количества добавленных клеток St. aureus. По этому графику определяют количество клеток St. aureus, достаточное для полного отделения связан- ного антителами и свободного гаптена (0,5 мл). Присутствие в среде инкубации молока не влияет на эффективность отде

ления ко.мплекса гаптена - антитело от. СЕюбодного гаптена.

Пример 2. Определение времени инкубации, необходи.мого для выполнения анализа. Все определения дублируются.

Добавляют в пробирки растворы реагентов, как в примере 1, но добавляют во все пробирки по 0,1 мл суспензии с концентрацией 0,5 мг клеток (0,1 мл), а в качестве нулевого стандарта используют коровье молоко, разбавленное дистиллированной водой в соотно1пении 1:5. Содержимое пробирок тщательно переме11 ивают и пробирки инкубируют 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5 ч при комнатной температуре, после чего обрабатывают, как в примере 1.

В линейных координатах строят график зависимости В/Т-100% от времени инкубации. Равновесие в системе наступает через 4 ч.

пример 3. Построение стандартной кривой. Все определения дублируются.

В пробирки добавляют растворы реа- |-ентов, как в примере 2, но добавляют не только нулевой стандарт, а и растворы стандартов прогестерона, содержащие 1,6; 6,3; 12,3; 25; 50 нг прогестерона в мл. Iloc. ie инкубации в течение 4 ч пробирки обрабатывают, как в при.мерах 1 и 2. Определяют величину В/Во-100% для каждого стандарта, где В связанпая радиоактивность в пробирках, содержащих стандартные количесп а прогестерона, и.мп/мин; Во - - связанная радиоактивность в пробирках, со.чержащих пу.левой стандарт, имп/.мин.

В линейных координатах строят стандартную кривую, откладывая по оси координат значение 100%, а по оси абцисс - концентрацию стандартов прогестерона в иг/мл.

в отличие от известного предлагаемый способ позволяет избежать предварительной длительной инкубации бактерий с антисывороткой и тем самым сократить время анализа на 1 сут. Поскольку реакция с антителом достигает равновесия, нет необходимости вводить стадию остановки реакции. Одностадийность процедуры анализа уменьшает вероятность ошибки оператора.

Предлагаемый способ позволяет определять концентрацию гаптенов в буферных растворах (например, в сыворотке крови после экстракции или при синтезе стероидов в ферментативнь Х реакторах) и в молоке (например, при определении концентрации прогестерона в молоке с целью определения стельности у коров).

Формула изобретения

Способ определения гаптенов, включающий инкубирование исследуемого образца, меченого гаптена и специфических антител с разделением свободного и связанного гаптена с помощью клеток Staphylococcus aureus.

1428384 34

отличающийся тем, что, с целью упрощения ного гаптена, специфических антител осуще- способа и сокращения времени определения, ставляют одновременно с клетками Staphylo инкубирование исследуемого образца, мече- coccus aureus.

Изобретение относится к био.хи.мии. Цель изобретения - упрощение способа и сокращение времени опреде,яения. После инкубации исследуемого образца, меченого гаптена, антисыворотки и суспензии клеток стафилококка aureus проводят центрифугирование. Про.мывают осадки, помещают пробирки с осадками в гамма-счетчик и измеряют количество импульсов. Способ позволяет определить стельность коров по концентрации прогестерона в молоке.