Способ определения энтеротоксина сальмонелл Советский патент 1986 года по МПК G01N33/53 G01N33/68 

1

Изобретение относится к медицине, а именно инфекционной патологий, и может быть использовано с эпидемиологическими целями 1пя выявления токсикоинфекций, вызванных сальмонеллами.

Цель изобретения - упроп(ение и ускорение способа определения саль- монеллезного энтеротоксина с сохранением высокой специфичности и чувствительности анализа.

Выросшую микробную культуру сальмонелл подвергают лизированию любым известным способом, центрифугируют и исследуют супернатант в реакции коагглю- тинации на часовом стекг(е с использованием стафилококковых клеток штамма Cowan I, содержащих белок А, соединенный с антителами, к термолабильному энтеротоксину кишечной палочки. Данная реакция возможна вследствие иммунологического родства эн- теротоксинов кишечной -палочки и сальмонелл.

Способ осуществляют следующим образом.

Выполненные при профилактических осмотрах или от больных людей, а также депонированные музейные культуры сальмонелл вьфащивают в Ш мл любой жидкой питательной среды в пробирках объемом 40-50 мл в течение 24-30 ч при непрерывном встряхивании шуттель аппаратом при 210 об/мин и при 37°С Далее проводят центрифугирование при 8000 об/мин в течение 15-20 мин, недостаточную жидкость отбрасывают, к осадку микробных клеток добавляют 0,5 мл дистиллированной воды и лизи- руют любым известнь:м способом. Затем полученные лизаты центрифугируют при 8000 об/мин в течение 15- 20 мин, осадок отбрасывают, а супернатант используют для дальнейшего исследования в реакции коагглютина- ции,

Для проведения этой реакции готовят стафилококковый диагностикум по следующей методике.

Культуру Staphifococcus aureus Cowan I выращивают на мясо-паптон- ном агаре Хоттингера (с содержанием аминного азота 180 мг %) в матрицах и смывают небольшим количеством (около 10-15 мл на 1 матрицу) 0,03 М фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,12 М NaCJ при рН 7,3, а также азид натрия в концентрации 0,1%.

555782

Полученную микробную взвесь отмывают в буфере трижды. Отмытые клетки суспендируют в фосфатно-солевом буфере и готовят взвесь микробов, со- 5 держащую 50-100 млрд. микробных клеток в I нл по оптическому стандарту мутности. К взвеси клеток добавляют коммерческий формалин до конечной концентрации в растворе 0,5%. 10 Формалинизирование проводят в течение 1 ч при 37°С на шуттель-аппара- те (100 об/мин). Клетки отмывают от формалина трижды фосфатно-солевым буфером, а затем в том же буфере 15 готовят 10%-ную взвесь клеток (по объему). Взвесь стабильна в течение 30 дн при 4°С,

Для сенсибилизации клеток Staphi- fococcus aureus Cowan I с целью по- 20 лучения сальмонеллезного диагности- кума в качестве источника специфических иммуноглобулинов используют антиэнтеротоксическую сыворотку к термолабильному энтеротоксину кишеч- 25 ной палочки с преципитирующим титром 1:16 и Bbmie, не содержащую антитела к другим антигенам кишечной палочки.

Сыворотку в количестве 0,1-0,2 мл 30 добавляют к 1 мл 10%-ной взвеси фор- малинизированных клеток St. aureus Cowan I, перемешивают в течение 2- 3 мин при комнатной температуре, затем однократно отмывают суспензию 35 от избытка антител при центрифугировании 1000 об/мин в течение 15- 20 мин. Осадок суспендируют в 10 мл фосфатно-солевого буфера. Реагентом в работе является взвесь стафилокок- 40 ков с адсорбированной на них антисывороткой. Срок хранения реагента при °С не более 1-2 недель,

В качестве контроля на годность использования реагента исследуют 45 его гомогенность в капле фосфатно- солевого буфера на стекле. При отсутствии спонтанной агглютинации efo используют для постановки реакции коагглютинации. При наличии спон- 5Q тайной агглютинации реагент бракуют. Для постановки опыта к 2-3 каплям реагента на часовом.или предметном стекле добавляют 1 каплю 1%-ной взвеси несенсибилизированных ста- 55 филококков. Капли на обоих стеклах размешивают осторожным покачиванием в течение 0,5-3 мин. Результаты реакции учитывают путем просмотра ка3

пель над вогнутым зеркалом и регистрируют появление агглютинации стафилококков. Интенсивность реакции обозначается по 4-ш1юсовой системе, как всякая реакция агглютинации. Образуется очень мелкий агглютинат и степень выраженности реакции определяется не столько размерами агглютинированных частиц, сколько степенью просветления жидкости в капле. При отрицательной реакции признаков агглютинации нет, жидкость гомогенно мутна.

Пример. Исследуют согласно предлагаемому способу штаммы сальмонелл, полученные из НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, выделенные от больных, и музейные культуры сальмонелл, депонирование в Институте стандартизации и

Полученные из ffiffl3M им. Н. Ф. Гамал

S,Typhimurium 415+

S.Typhimurium м.ч.++

S.Typhimurium М+++

S.Typhimurium 16+

S.Typhimurium 17++

S.Typhimurium 18+/-/

S.Typhimurium 19+

S.Typhimurium 118++++

S.Typhimurium 74

S.Typhimurium 32+

S.Typhimurium 33++++

S. enteritidis м.ч.

Депонированные в Институте стандартизации и контроля медицинских био- логических препаратов им. Л. А. Тар севича

S. typhimurium 978 S. choleraesuis 7378

555784

контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Результаты исследований представлены в таблице.

5

Как видно из таблицы, международ- ные эталонные штаммы сальмонелл (штамм SafmonelPa typhimurium S-2- 3235), также как и энтеротоксигенная

10 кишечная пап-очка, служащая контролем (Штамм Н-10407), дают положительную реакцию коагглютинации. Штамм К. pneumonia, не продуцирукнций энтероток- . син и служащий контролем, характе(5 ризуется отрицательной реакцией. Интенсивность продукции знтеротоксина другими испытуемыми штаммами сальмонелл оказалась различной (от О до ++++).

+/-/

+++

S. heideberg 287

S. anatum 1120

S. bredeney 210

S. ejeda 1424

S. goodwood 1471S. ebrie 200

S. bovaire 1323

S. bafboa 1886/76

S. enteritidil 27036

Контр Фосфатный буфер

Klebscella pneumonia

ST 9-19E. colt H 10407

Редактор И. Дербак

Составитель Н. Хрусталева

Техред М.ХоданичКорректор М, Максимипганец

Заказ 4779/26Тираж 778Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий i13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

, -. , --- - Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4