Способ иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека и животных Советский патент 1988 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к способам количественного определения гесте- рона в сыворотке крови человека и животных и может быть использовано для дифференциальной диагностики бесплодия и контроля за его лечением, наблюдения за протеканием беременности, выявления гинекологических заболеваний человека и животных и исследовательских целей.

Цель изобретения - сокращение времени анализа до 3-4 ч и его упрощение.

, 0,15 М NaCl, рН 7,4) с разными концентрациями от М, добавляют 0,02 мл раствора коньюгата ПХ-ПРОГ в ЗФР с концентрацией 1,43 нМ и 0,02 мл раствора антисыворотки к прогестерону с разбавлением 1:60 . (конечное разбавление в инкубационной среде 1:420). Смесь инкубируют 60 мин и при 20 С. К смесям добавляют 0;28 мл 25%-ного раствора ПЭГ 6000 в ЭФР с рН 7,4 и спустя 20 мин центрифугируют смеси при 8000 об/мин в течение 7 мин. Осадок отделяют и

Изобретение относится к акушерству, точнее к способам количественного определения прогестерона в сыво- ротке крови животных и человека, касается дифференциальной диагностики бесплодия и контроля за его лечением. наблюдения за протеканием беременности, выявления гинекологических заболеваний человека и животных и исследовательских целей. Цель изобретения - сокращение времени анализа до 3-4 ч и его упрощение. Для этого - предложен способ псевдогомогенного иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека и животных, заключающийся в том, что свободный прогестерон и прогестерон, меченный пероксидазой хрена, инкубируют с антителами к прогестерону, добавляют к смеси полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ бООО), центрифугируют и в осадке определяют активность связанной пероксидазы по окислению орто- дианизидина перборатом натрия или перекисью водорода. По калибровочной зависимости находят коцентрацию прогестерона. Способ позволяет безэкстракционным путем определять микро- лсоличества прогестерона и сократить время анализа. СО 00 о ts5

Пример 1. Получение антисыво-15 ресуспендируют в 2,8 мл цитратноротки к прогестерону (Анти-11-ПРОГ). Получают коньюгат БСА-ПРОГ, растворяют 50 мг (0,72 мкмоль) БСА в 5 мл 0,1 М раствора ШаНСО, (рН 8,35)

ацетатного буфера с рН 6,0, содержащего 0,34 М ортодианизидирга и 0,1% Тайна 20, добавляют 0,2 мл того же буфера, содержащего 1,07 мМ пербораи добавляют 25 мг (48,6 мкмоль) ПРОГ 20 та натрия и в термостатированной кю- в 5 мл диметилформамида. Перемешивают . вете спектрофотометра Speco 1-20

30

35

смесь 20 ч при 20 С. Конечные концентрации добавленных веществ в растворе: БСА 6 мг/мл, ПРОГ 2,5 мг/мл, 50 об.% димет1Шформамида. Непрореаги- ровавшее производное прогестерона удаляют диализом коньюгата БСА-ПРОГ против дистиллированной воды до исчезновения в диализате поглощения прогестерона на длине волны 250 нм. Количество связавшихся с БСА молекул прогестерона определяют ..спектрофото- метрически, измеряя оптическую плотность раствора коньюгата на длинах волн 250 и 280 нм и используя при , расчете коэффициент молярной экстинк- ции прогестерона, равный 1, (21). В работе используют коньюгат БСА-ПРОГ, содержащий 35-40 молекул прогестерона на 1 молекулу БСА. 40

Антисыворотку к прогестерону получают многократной иммунизацией кроликов смесью общим объемом 1 мл, содержащей 1 мг коньюгата БСА-ПРОГ, 0,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл 45 полного адъюванта Фрейнда, по следующей схеме: 1-й месяц еженедельно, затем ежемесячно. Через 5-8 мес берут кровь на тестирование. Кровь берут на 7-10-й день после последней

t

50

(ГДР) регистрируют в течение 30 с оптическую плотность раствора при 460 нм. Расчитывают начальную скорость реакции окисления ортодианизи- дина (о-ДЛ) для каждой из систем, содержащих разные концентрации прогестерона. Строят калибровочг{у10 зависимость в координатах начальная скорость реакции - логарифм концентрации прогестерона.

Аналогично описанному обрабатывают смеси, содержащие неизвестные концентрации прогестерона, и после вычисления начал ных скоростей окисления о-ДА, по калибровочной зависимости определяют концентрацию прогестерона в пробе. Способ анализа позволяет определять прогестерон в интервале концентраций 10 -10 М.

П р и М е р 2. Антисыворотку к прогестерону получают аналогично примеру 1. В пробирки, содержащие по 0,1 мл растворов в ЗФР прогестерона с разными концентрациями, добавляют 0,02 мл раствора антисыворотки к прогестерону в ЗФР с конечным разбавлением 1:252 и выдерживают смеси 1 ч при 20°С. Затем во все пробирки добавляют по 0,02 мл раствора коньюгата ПРОГ-ПХ в ЗФР с концентрацией 33,0 нМ конечная концентрация 4,71 нМ| и инкубируют смеси еще I ч при той -же температуре. Во все пробирки добавляют по 0,28 мл раствора ПЭГ бОО О в ЗФР с концентрацией 25% (конечная концентрация 16,66%) и инкубируют смеси 20 мин при 20 С, после чего центрифугируют их при

иммунизации из краевой вены уха кролика, выдерживают ее при 37 С и 18- 20 ч при 4 С, центрифугированием отделяют сыворотку и используют ее в дальнейшей работе.

Проведение анализа,

В пробирке, содержащей ,1 мл раствора прогестерона в забуференном физиологическом растворе (ЗФР 0,1 М

ацетатного буфера с рН 6,0, содержащего 0,34 М ортодианизидирга и 0,1% Тайна 20, добавляют 0,2 мл того же буфера, содержащего 1,07 мМ пербора0

5

0

5

t

0

5

(ГДР) регистрируют в течение 30 с оптическую плотность раствора при 460 нм. Расчитывают начальную скорость реакции окисления ортодианизи- дина (о-ДЛ) для каждой из систем, содержащих разные концентрации прогестерона. Строят калибровочг{у10 зависимость в координатах начальная скорость реакции - логарифм концентрации прогестерона.

Аналогично описанному обрабатывают смеси, содержащие неизвестные концентрации прогестерона, и после вычисления начал ных скоростей окисления о-ДА, по калибровочной зависимости определяют концентрацию прогестерона в пробе. Способ анализа позволяет определять прогестерон в интервале концентраций 10 -10 М.

П р и М е р 2. Антисыворотку к прогестерону получают аналогично примеру 1. В пробирки, содержащие по 0,1 мл растворов в ЗФР прогестерона с разными концентрациями, добавляют 0,02 мл раствора антисыворотки к прогестерону в ЗФР с конечным разбавлением 1:252 и выдерживают смеси 1 ч при 20°С. Затем во все пробирки добавляют по 0,02 мл раствора коньюгата ПРОГ-ПХ в ЗФР с концентрацией 33,0 нМ конечная концентрация 4,71 нМ| и инкубируют смеси еще I ч при той -же температуре. Во все пробирки добавляют по 0,28 мл раствора ПЭГ бОО О в ЗФР с концентрацией 25% (конечная концентрация 16,66%) и инкубируют смеси 20 мин при 20 С, после чего центрифугируют их при

8000 об/мин в течение 7 мин. Супер- натант удаляют, осадок растворяют, добавляя 2,8 мл цитратно-ацетатного буфера с рН 6,0, содержащего О,Iвес.% Твин 20, затем в системы добавляют 0,1 мл раствора (о-ДА) в диметилфор- мамиде (ДМФ) до концентрации 0,4 мМ и 0,1 мл раствора пербората натрия до концентрации 1,0 мМ и при в кювете спектрофотометра регистрируют в течение 30 с изменение оптических плотностей раствора. Вычисляют значения начальных скоростей окисления о-ДА во всех системах и делят на величину начальной скорости реакции окисления о-ДА в контрольной системе, не содержащей прогестерона. Строят калибровочную зависимость относительная скорость окисления о-ДА в % к контрольной - логарифм концентрации прогестерона.

Аналогично обрабатывают смеси, содержащие неизвестные концентрации прогестерона в растворах, и после вычисления начальных скоростей окисления о-ДА в % к контрольной определяют искомые концентрации прогестерона по калибровочной зависимости.

Предлагаемый способ анализа позволяет зо добавлением меченого пероксидазой

определять прогестерон в интервале концентраций 10 -10 моль/л.

ПримерЗ. Б пробирки, содержащие 0,05 мл человеческой сыворотки с нулевой концентрацией прогестерона, т, добавляют 0,05 мл растворов прогесте. 45

рона в ЗФР с разным концентрациями от 3.10 до 1 , М и по 0,02 мл раствора антисыворотки к прогестерону в ЗФР с конечным разбавлением 1:532 и выдерживают смеси 1 ч при 20 С. Затем во все пробирки добавляют 0,02 мл раствора коньюгата ПХ-ПРОГ в ЗФР с концентрацией 33,0 нМ (конечная концентрация 4,71 нМ) и инкубируют смеси еще 1 ч при той же температуре. Во все пробирки добавляют 0,28 мл раствора ПЭГ 6000 в ЗФР с концентрацией 25% (конечная концентрация 16,66%) и инкубируют смеси 20 мин при 20 С, после чего центрифугируют их при 8000 об/мин в течеВНИШШ Заказ 1181/40 Тираж 847

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

ние 7 мин. Супернатант удаляют, осадок растворяют, добавляя 2,8 мл цит- ратно-ацетатнрго буфера с рН 6,0, содержащего 0,1 вес.7, Твина 20, затем в системы добавляют 0,1 мл раствора о-ДА в ДМФ до концентрации 0,4 мМ и 0,1 мл раствора пербората натрия до концентрации 1,0 мМ, и при 20 С в кювете спектрофотометра регистрируют в течение 30 с изменение оптических плотностей растворов. Вычисляют значения начальных скоростей окисления о-ДА во всех системах. Строят калибровочную зависимость начальная скорость окисления о-ДА - логарифм концентрации прогестерона.

Предлагаемым способом анализа можно определять прогестерон в интервале концентраций 10 -10 моль/л.

Предложенный способ иммунофермент- ного определения прогестерона в сыворотке крови позволяет безэкстрак- ционпым путем определять микроколичества прогестерона и сократить время анализа до 2 ч при конкуретной схеме его проведения и до 3 ч при проведении анализа по схеме с поздним

прогестерона. При этом достигается

чувствительность до 10 моль/л.

Формула изобретения

Способ иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека и животных путем инкубирования свободного прогестерона и прогестерона, меченого -пероксидазой хрена, с антителами к прогестерону, разделения свободной и связанной форм и последующего определения концент- рации прогестерона по активности пероксидазы хрена, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения, инкубирование прогестерона с антителами к нему проводят в растворе, а для разделения связавшихся и несвязавшихся с антителами антигенов используют полиэтиленгликоль 6000.

Подписное