Способ оценки специфической антиген-связывающей активности антисыворотки Советский патент 1983 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медицине в частности к прикладной иммунологи а именно к способам оценки свойств антисывороток против любого рода антигенов, преимущественно к способам оценки их специфической антиген-связывающей активности, и может быть использовано для количественного сравнения сродства антисывороток к родственным антигенам-. Известен способ оценки специфической антиген-связывающей активнос антисыворотки к антигену путем приготовления последовательных разведений антисыворртки, добавление нативного и меченоЬо антигена с последующим инкубированием полученных смесей, добавлением второй системы антител, повторной инкубацией и определением антиген-связывающей активности антисыворотки по радиоактивности связанного меченого антигена. Показателем антигеи-связывающей активности при этом служит значение титра антисыворотки, при котором Наблюдают максимальную преципитш ию антигена, т.е. , на который/ приходится так навываенклй пик кривой титрования Гейдельбрегера tl. Однако известный способ недостаточно точен. Целью изобретения является повышение точности способа. Указанная цель достигается тем, что согласно способу оценки антиген-связывающе.й активности антисыворотки путем приготовления поспе довательных разведенийантисывороткй, добавления нативного и меченого анти гена с последую1ф1м инкубированием полученных смесей, добавлением второй системы антител, повторной инкубацией и определением антиген,-свя зывающей активности антисыворотки по радиоактивности связанного меченого антигена, используют последовательные разведения нескольких серий антисыворотки, иативный анти ген добавляют в ЪозрастаюЕцих концентрациях от серии к. серии аитисыворЬтки, по постоянно концентрации для серии и после повторной инкубации определяют антиген-связывающую активность антисыворотки, которую вычисляют по формуле

(VSFo ivsro. .rfHliVi

AI 7 « «- , PoTV - T.

где A - антиген-связывающая активность (концентрация антигена, наличие которой в цельной сыворотке обеспечит 50%-ное связывание антигена антителами ) ; j - количество серий титрования антисыворотки, отличных fto концентрации стандарта нати вного антигена, включая 0концентрацию ; Сд ,- концентрация нативного анти гена в очередной серии титрования, включаяконцентрацию, равную нулю ; Тр - радиоиммунологический титр антисыворотки в очередной серии титрования включая серию нуль(РИА-титр 50%-ному уровню связывани радиомеченого антигена в процентах к максимальному уровню связывания, .равному 100%), О сродстве антисыворртки антигену судят по величине угла наклона кривой титрования в точке радиоимму нопогического титра. Алгоритм нахождения половинной точки и угла наклона кривой титрова ния в этой точке реализован апрокси мацией экспериментальной кривой сплайн-функцией третьего порядка на языке фортран-4 Пример . Проводят оценку антиген-связывающей активности антисыворотки индуцированной к челове ческому инсулину и морркой свинки . Готовят серию разведений исследуемой сыворотки в диапазоне 1:301:3000000 с помощью 0,5 М фосфатног буфера рН 7,5 л 1% альбумина бычьег и 0,3% этилендиаминтетраацетата нат рия (буферный раствор 91), в первую серию реакционных пробирок вносят по 0,1 МП буферного раствора W 1, во вторую серию - тот же бу ферный раствор с концентрацией международного стандарта инсулина в не 100 мкед/мл, в третью серию - с кон центрацией стандарта инсулина 300 мкед/мл, а в четвертую серию с концентрацией стандарта инсулина 900 мкед/мп. Далее во все пробирки вносят по 0,1 МП раствора инсулина 125 (0,02 мк/кгори 1 атом йода - 125

,J()o ,(,...,(rVin-i .,.,.

т,/т,-1 TO/T -I 4j,/Tj-i на мол пептида . Инкубацию выполняют 12-24 ч при 4°С. В пробирки вносят по 0,1 мл 1:10 антисыворотки к иммуноглобулинам морской свинки. Вторую инкубацию выполняют 24-36 ч при .4°С. Пробирки центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин, супернатант сливают. Пробирки центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин, супернатант сливают. Просчитывают радиоактивность реакционных пробирок с выделенным преципитатом. На фиг. 1 (аи б представлены результаты радиометрии, которые подвергают графической обработке. Угол наклона кривых титрования для точки РИА-титра (радиоиммунологический титр антисыворотки составляет при .этом 25,4-33,0. Погрешность определения значения параметра А составляет 13,5±3,5% (в то время какв прототипе она составляла 240i53%). Таким образом, способ позволяет осуществлять контроль любых антисывороток в полях/мл связываемого антигеча при их производстве и производстве диагностикумов. (РИА-инсулин, РИА-СТГ% соматотропина и пр., а также повышает точность способа. Формула изобретения Способ оценки специфической антиген-связывающей активности антисыворотки путем приготовления последовательных разведений антисыворотки, добавления нативного и меченого антигена с последующим инкубированием полученных смесей, добавлением второй системы антител, повторной инкубацией и определением антиген-связывакицей активности антисыворотки по радиоактивности связанного меченого антигена, отличающий с я тем, что, с целью повышения точности способа, используют последовательные разведения нескольких серий антисыворотки нативный антиген добавляют в возрастающих концентрациях от серии к (ерии антисыворотки, по постоянной концентрации для кашдой серии и после повторной инкубации определяют антигенсвязывающую активность антисыворотки, которую вычисляют по формуле

де А - антиген-связывающая активность Iконцентрация антигена, наличие которой в цельной сыворотке обеспечит 50% связывание антигена антителами}{

j - количество серий.титрования антисыворотки, отличных по концентрации стандарта нативнрго антигена, включая 0-концентрацию; концентрациянативного ан-0-Jтигена в очередной серии титрования, включая концентрацию, равную нулю;

радиоиммунологический титр антисыворотки в очередной серии титрования, включая серию нуль (РИА-титр 50%-ному уровню связывания радиомеченого антигена процентах к максимальному уровню связывания, равному 100%}.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Фримель X. Иммунологические методы. М., Мир, 1979, с. 430.

--3S.S%

1J27B

1IJ6

1130

Ifm

1f2m (fffd fffeffi e внтиЛ1ютт)

п.1,а

,3%

1130

|t Dii8w

ilSD

иг.1,6

Тигр KUA

-.

v.:-.::

-- I...

Vi:v.

-1««1

1/2m (Разбе ние , aftmucul of micu)