Сорбент для выделения и очистки тромбопластина и способ его получения Советский патент 1988 года по МПК G01N30/48 B01D15/08 

4 ГС

00

4 05 4

Изобретение относится к химически модифицированным кремнеземHbiiM сорбентам для хроматографии бионолимеров и может быть иснользовано для выделения и очистки тромбонластина.

Тканевый тромбопластин (фактор III свертывания крови) представляет собой высокомолекулярный линопротеидный комплекс с мол. м. 300000. Он является инициа- трром внешнего пути свертывания крови, а;ктивируя совместно с факторм Vila тром- бркиназу, которая активирует протромбин, Превращая его в активный тромбин.

Целью изобретения является повышение выхода и степени очистки тромбопластина и создание способа получения сорбента, обеспечива юшего возможность его использования при хроматографическом выделении тромбопластина.

Пример I. В трехгорлую колбу на 300 мл с термометром, мешалкой и обратным холодильником помещают 20 г сило- .чрома С-80 (средний размер нор 50 нм) и заливают ацетатным буферным раствором с рН 5,6 в количестве 100 мл. Суспензию нагревают на водяной бане до 90°С и добавляют 5 г модификатора - у-глицидо- оксипропилтриэтоксисилана. Реакционную смесь нагревают в течение 1 ч при пере- мен1ивании. Полученный модифицированный носитель промывают на фильтре водой, ацетоном, эфиром и далее абсолютированным диоксаном по 100 мл. Промытый сорбент помещают в трехгорлую колбу на 500 мл добавляют 100 мл абсолютного диоксана, 5 мл эфирата трехфтористого бора, 25 мл глицерина и перемешивают суспензию. После перемешивания суспензию выдерживают 5 мин при комнатной температуре, затем 30 мин нагревают на водяной бане, фильтруют, промывают диоксаном, водой, 5%-ной уксусной кислотой, водой, ацетоном, эфиром и высуши ают на воздухе. Содержание углерода в полученном сорбенте 2,5%, что соответствует 1,2 привитых групп на 1 им поверхности носителя. В ИК-снектрах сорбента обнаружены полосы поглощения в области, см : 3600-3400; 2965-2900; 2815- 2830.

Полученный сорбент используют для очистки тромбопластина. Экстракт липопро- теидного комплекса тромбопластина готовят следующим образом.

5 г лиофильно высушенного кадавер- ного-мозга человека гомогенизируют в фарфоровой ступке с 50 мл 0,15 М хлористого натрия и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин. Осадок отбрасывают, а полученный супернатант подвергают хроматографической очистке.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

Колонки размером 20X0,8 см наполняют сорбентом и уравновешивают раствором, в котором проводили экстракцию тромбопластина. Через колонку со скоростью 0,08- 0,4 мл/см мин пропускают экстракт тромбопластина, собирая фракции по 0,85 мл. Во всех фракциях определяют мутность (поглощения света при 540 нм и длине оптического пути 1 см), содержание белка при помощи кумасси G-250, а также специфическую активность.

При использовании предложенного сорбента выход составляет 91% при очистке в 5,8 раз.

Пример 2. В условиях примера 1 варьируют диаметр пор исходного кремнезема, снимают ИК-спектры получаемых сорбентов, из данных анализа на углерод и удельной поверхности определяют содержание групп на 1 нм поверхности, полученные сорбенты используют для выделения и очистки тромбопластина.

В таблице приведены результаты очистки тромбопластина на предложенном сорбенте с различным диаметром пор, и на известном сорбенте.

Анализ данных, представленных в таблице, показывает, что эффект достигается при использовании сорбента предложенной структуры при диа.метре пор исходного носителя 45-75 нм и количестве привитых групп 1,2-2,6 групп на 1 нм.

Формула изобретения

1.Сорбент для выделения и очистки тромбопластина на основе макропористого кремнезема с диаметрами пор 45-75 нм с химически привитыми к его поверхности гликолевыми группами, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и степени очистки тромбопластина, он содержит гликолевые группы формулы

(СН2)зОСН2СН(ОН)СН20СН2СП (ОН) X

ХСПгОН

при их поверхностной концентрации 1,2-

2,6 групп/нм .

2.Способ получения сорбента, включающий модифицирование макропористого кремнезема v-глицидооксипропилтриэтокси- силаном с последующей обработкой гид- роксилсодержащим органическим соединением в среде диоксана в присутствии эфирата трехфтористого бора, отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности его использования при хроматографичес- ким выделении тромбопластина с высоким выходом и высокой степенью чистоты, в качестве гидроксилсодержащего соединения используют глицерин.

Изобретение относится к химически модифицированным кремнеземным сорбентам для хроматографии биополимеров и может быть использовано для выделения и очистки тромбопластина. Получают сорбент на основе макропористого кремнезема с диаметром пор 45-75 нм, содержащий на поверхности группы формулы -(СН2)зОСН2Х хСН(ОН)СН20СН2СН(ОН)СН2ОН при их поверхностной концентрации 1,2-2,6 групп на 1 нм. Способ получения сорбента заключается в последовательной обработке кремнезема с диаметром пор 45-75 нм 7-глицидооксипропилтриэтоксисиланом и глицерином в среде диоксаца в присутствии эфирата трехфтористого бора. При использовании сорбента, получаемого по предлагаемому способу, достигается выход тромбопластина 91-94% при очистке 5,6- 6,1 раз, что превышает характеристики известных сорбентов, предназначенных для аналогичной цели. 2 с.п. ф-лы, 1 табл. с S (Л