Способ получения сорбента для хроматографического разделения биополимеров Советский патент 1985 года по МПК B01J20/10 

О) СП

сд Изобретение относится к способам получения сорбентов для разделения и очистки биополимеров и может быть использовано для хроматографической очистки вирусных суспензий при приго товлении вакцин. Цель изобретения - повышение разделяющс|й способности и стабильности сорбента. Сущность способа заключается в последовательной обработке кремнезема - АПТЭС, сополимером N - винилпирролидона и акрилоилхлорида и этаноламином. Согласно изобретению для получения сорбента используют макропористый кремнезем, характеризующийся средним размером пор 1100 А - 2000 А и удельной поверхностью 20-50 м/г. Обработку кремнезема раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида осуществляют при комнатной температуре, 1,5-2 ч. Используют 1-4% -ный (лучще 2-3% -ный) раствор сополимера в органическом растворите ле, выбранном из группы: диметилформамид, диоксан или их смесь. При использовании раствора сополи мера с концентрацией меньше 1% снижается разделяющая способность сорбента, при содержании сополимера больше 4% сополимер выпадает в ос.адок.Взаимодействие с этаноламином про водят также при комнатной температуре 2-16 (лучше 10-15)4. Перед обработкой раствором сополи мера кремнезем модифицируют известным приемом 1-4% -ным раствором jАПТЭС в органическом растворителе при нагревании до 70-120с. В качест ве растворителя применяют алифатические спирты Cj-C, алифатические углеводороды С., а также ароматические углеводороды Сд. Температура обработки раствором j--АПТЭС обычно определяется температурой кипения соответствующего растворителя, Продолжительность модификации уАПТЭС составляет 2-4 ч для спиртовьис растворов и 20 - 36 ч в случае приме нения углеводородных растворителей. Отделение непрореагировавшего уАПТЭС осуществляют путем многократной экстрации органическим растворителем (эталоном, ацетоном, толуолом, диоксаном). Пример. 15г макропористог кремнезема с диаметром пор 1100 А обрабатывают кипящим 3% -ным раствором -j--АПТЭС в изопропаноле 3 ч, затем промывают 8 ч. изопропанолом в эстракторе Сокслета и сушат при 1 ч, а далее при 2 ч под вакуу мом. 15 г полученного материала обра батывают при перемешивании 3% -ным раствором сополимера N-винилпирроли дона и акрилоилхлорида (соотношение мономерных звеньев 1:1, характеристическая вязкость 0,20-0,25 дл/г) в сухом диоксане 2 ч при 25с. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порциями по 100 мл сухого диоксана и добавляют при перемешивании 5 г этаноламина. Через 10 ч после добавления этаноламина диоксановый раствор декантируют и сорбент промывают дистиллированной водой до нейтрального рН. Пример 2. 50 г макропористого кремнезема с диаметром пор 1600 А обрабатывают кипящим 4% -ным раствором в этаноле 3 ч, промывают 8 ч этанолом в экстракторе Сокслета и сушат при 20°С 1 ч, а затем при 2 ч под вакуумом 50 г полученного материала обрабатывают при перемешивании 3% -ным раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида {соотношение мономерных звеньев 1:1, характеристическая вязкость 0,20 - 0,25 дл/г) в сухом диметилфррмамиде 2 ч при . После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порциями по 300 мл сухого диметилформамида. Добавляют 5 г этаноламина и перемешивают. Через 2 ч после добавления этаноламина диметилформамидный раствор декантиру,ют и сорбент промывают дистилированной водой до нейтрального рН. Примерз. 300 г макропористого кремнезема с диаметром пор 2000 А обрабатывают кипящим 2% -ным раствором у-АПТЭС в толуоле 30 ч, промывают свежими порциями сухого толуола (Зх1л) и сухого диоксана (Зх1л). к полученной смеси кремнезема и органических растворителей прибавляют при перемешивании 1 л 2% -ного раствора сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида (характеристики сополимера те же, что в примере 1) в сухом диоксане и перемешивают 2 ч при 25с. После обработки раствором сополимера сорбент четыре;кды промывают порциями по 1 л сухого диоксаиа. Добавляют 50 г этаноламина и перемешивают. Через 16 ч после прибавления этаноламина раствор декантируют и сорбент промывают дистиллированной водой до нейтрального рН. Пример4. 50 г макропористого кремнезема с диаметром пор 200оА обрабатывают 1% -ным раствором тАПТЭС в декане 20 ч при , промывают 8 ч этанолом в экстракторе Сокслета и сушат при 1 ч, а затем 2 ч под вакуумом при . 50 г полученного материала обрабатывают при перемешивании 2% -ным раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида (характеристики сополимера те же, что в примере 1) в смеси сухих диоксана и диметилформамида (объемное соотношение 1:1) и перемешивают 2 ч при 25°С. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порциями по 300 мл сухого диоксана. Добавляют 5 г этаноламина и перемешивают. Через 2 ч после прибавления этаноламина раствор декантируют и сорбент промывают днетиллированной водой до нейтрального рН.

Примерз. 50 г макропористого кремнезем 1 с диаметром пор 2000 А обрабатывают 2% -ным раствором у АПТЭС в толуоле в течение 20 ч при IIOC, промывают 8 ч ацетоном в аппарате Сокслета и сушат при 1 ч а затем 2 ч под вакуумом при . 50 гр полученного материала обрабатывают при перемешивании 1% -ным раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида в диоксане (характеристики сопрлимера те же, что в примере 1) 2ч при 25С. После обработки раствором сополимера сорбент четырежды промывают порциями по SCO мл сухого диоксана и прибавляют, перемешивая, 5 г этаноламина. Через 2 ч Параметры очистки вирусной суспензии на

после этого сорбент промывают дистиллированной водой до нейтрального рН.,

О р и м е р 6. Синтез сорбента проводится аналогично примеру 5, но вместо 1% -ного раствора сополимера в реакцию вводят 0,5% -ный раствор того же сополимера.

Полученный по примерам 3-6 сорбен помещают в колонку размером 1х40см, :промывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М NaCt со скоростью 1 мл/мин и в тех же усло.виях хроматографируют суспензию ви-руса гриппа (штамм А385) .Объем вводимо пробы 1 мЛу концентрация гемагглютинина 250 мкг/мл, концентрация белков 400 мг/мл.

Содержание гемагглютинина, характеризующего выход собственно вируса, примесных белков по Кумасси и реакция гемагглютинирующей активности (РГА) во фракциях вирусного препарата, полученных на известных и предлагаемых сорбентах, приведено в таблице. различных сорбентах

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕВИЯ БИОПОЛИМЕРОВ, включающий обработку кремнеземного носителя раствором, содержащим полимер N- винилпирролидона, отличающийся тем, что, с целью повьшения разделяющей способности и стабильности .сорбента, в качестве носителя используют модифицированный у- аминопропилтриэтоксисиланом кремнезем и обработку ведут раствором сополимера N-винилпирролидона и акрилоилхлорида в органическом растворителе с последукяцим контактированием с раствором этаноламина. 2. Способ по П.1 отличаю.щ и и с я тем, что используют 2-3%ный раствор сополимера м-винилпирролидона и акрилоилхлорида.

При описанном способе синтеза макромолекулы модифицирующего полимера располагаются исключительно по поверхности кремнезема и не заполняют внутренний объем пор сорбента. Это приводит к увеличению разделяющей способности сорбента. Вымывание полимера, модифицирующего поверхность, отсутствует. В таблице приведены данные, характеризующие разделяющую способность сорбентов, полученных по заявляемому и известному способу.

Как показывает таблица, вирусная суспензия, полученная на сорбенте, полученном по настоящему изобретению содержит меньше примесных белков при том же или даже большем выходе вируса. Это свидетельствует о повыпюнной разделяющей способности сорбента, полученного по предлагаемому спо собу. В таблице приведены также значения реакции гемагглютинирующей активности вируса (РГА), характеризующей сохранение его биологической функции. При использовании сорбента,

полученного по заявляемому способу, РГА не только не снижается, но становится выше, чем при использовании известного сорбента.

Аналогичные результаты получены для сорбента, приготовленного в соответствии с примером 5, тогда как сорбент по примеру 6 характеризуется пониженными значениями выхода вируса и РГА.

Пример 7.Через колонку 1x40 см заполненную сорбентом полученным lib данному изобретению, пропускали 4 л фосфатного буферного раствора (0,01 М, рН 7,4), содержащего 0,1 М МаСг . Такое промывание соответствует 100 хроматографическим разделениям. При повторении хроматографии после такой промывки выход гемагглютинина не изменяется. Содержание примесных белков остается ниже, чем при использовании сорбента, полученного по способу-прототипу.

Таким образом, предлагаемый способ получения сорбента позволяет по-,

j11667516

лучить стабильный хроматографическийрегенерации. Очистка вирусной суспеиматериал, пригодный для многократно-зии от вирусных белков при этом осго использования (не меньше 100 раз-тается вьше,чем при использовании сорделений против 5 для прототипа) безбента,полученного известным способом.