Способ получения сорбента для очистки ферментов и белков Советский патент 1987 года по МПК B01J20/10 B01D15/08 

Изобретение относится к способу получения сорбента для очистки ферментов и белков и может быть использовано в производстве высокоочищен- ных белковых препаратов и ферментов.

Цель изобретения - повышение сорб ционной емкости сорбента.

Пример 1. 150 г силохрома С-80 обрабатывают при перемешивании 800 мл 2%-ной азотной кислоты в те- чение 2 ч при 90°С. После этого гид- роксилированный носитель отфильтровывают, промывают водой до нейтральной реакции промывных вод и отжимают на фильтре. Влажный полупродукт исполь- зуют для дальнейшей обработки без высушивания. Его обрабатывают 675 мл 10%-ого водного раствора эпоксипро- пилтриэтоксисилана при- рН 3,5-4,5 в течение 2 ч при , периодически перемешивая. Продукт отфильтровывают промывают .водой, ацетоном и высушнпл шт.- Содержание эпоксигрупп для сило- хрома С-80 составляет 50 мкмоль/г

В шестилитровую трехгорлую колбу, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником и капельной воронкой, заливают 966 мл эпихлоргидри- на и поднимают температуру до . В капельную воронку заливают раствор фенола, который получают при растворении 1 кг фенола в растворе NaOH (513 г NaOH растворяют в 1835 мл дистиллированной воды). Раствор Фенола

вводят в ЭПИХЛОРГИДРИН при ПОСТОЯ1Гном перемешивании смеси в течение 4,5-5 ч. После реакции смесь фильтруют, а фильтрат промывают в делительной воронке 6-8 порциями воды (по 1-1,5 л). Верхний слой собирают, высушивают над безводным MgSO. Продукт очищают вакуумдистилляцией при 92°С (6 мм рт.ст.). Получают 460 - 480 мл фенилглицидилового эфира (вы- ход - 50%).

20 г глицидилсилильного силохрома .С-80, полученного, на первой стадии, заливают 80 мл абсолютного диоксана, содержащего 2 мл (7,4 1 лиганда на 10 г носителя) фенилглицидилового эфира, полученного на второй стадии, добавляют 1,6 мл свежеперегнанного эфирата трехфтористого бора, смесь перемешивают 5 мин при комнатной температуре, затем 2 ч при . Продукт отфильтровыва от, промывают диок саном, водой, ацетоном и высушивают

о

5

Q С

п г

при 110-115°С. Концентрация лиганда в сорбенте 79,5 мкмоль/г.

Пример 2. 20,Ог глицидилсилильного силохрома С-80, полученного по примеру 1, заливают. 80 мл. абсолютного диоксана, содержащего 3 мл фенилглицидилового эфира (И мМ лиганда на 10 г носителя) и реакцию проводят по примеру I. Концентрация лиганда в сорбенте 103 мкмоль/г.

ПримерЗ. НаЮОг глицидилсилильного силохрома С-.120, полученного по. примеру 1 (при использовании в качестве носителя силохрома С-120), заливают 350 мл абсолютного диоксана, добавляют 20 мл фенилглицидилового эфира (11 мМ лиганда на 10 г носителя), добав.аяют 7,4 мл эфирата трехфтористого бора и реакцию проводят по примеру 1. Концентрация лиганда в сорбенте 122,3 мкмоль/г.

П р и м е р 4. 70 г глицидилсилильного силохрома С-80, полученного по примеру , заливают 245 мл абсолютного диоксана, содержащего 10,5 мл фенилглицидилового эфира (П мМ лиганда на 10 г носителя), полученного по примеру 1, добавляют 4,9-мл (0,7 мл на 10 г носителя) свежеперегнанного эфирата трехфтористого бора и реакцию проводят по примеру 1. Концентрация лиганда в сорбенте 84,8 мкмоль/г.

.П р и м ер 5. 20,5 г глицидилсилильного силохрома С-80, полученного по примеру I, заливают 102,5 мл 5 мМ раствором НС 1 и эпоксигруппы носителя гидролизуют до диольных перемешиванием суспензии 2 ч при комнатной температуре. Носитель отфильтровывают, промывают водой, этанолом и высушивают. 20 г по.пученного диольиого силохрома С-80 заливают 80 мл абсолютного диоксана, содержащего 2 мл фенилглицидилового эфира (7,4 мМ лиганда на .10 г носителя), добавляют I,6 мл эфирата трехфтористого бора, смесь перемешивают 5 мин при комнатной температуре и 2 ч при . Сорбент промывают диоксаном, водой, ацетоном и высушивают. Концентрация лиганда в сорбенте 69,4 мкмоль/г.

Сорбционную емкость сорбентов определяют в условиях статической сорбции в 0,02 М натрий-фосфатном буфере . рН 7., 1, содержащем 2 М NaCl. 1 г сорбента, полученного по примерам 1-5, уравновешивают исходным буфером, декантируют и заливают 3 мл раствора

альбумина человеческой сыворотки (Реанал, ВНР) с концентрацией 20 мг/м в буфере с 2 М NaCl. Суспензию сор- бента перемешивают 2 ч при комнатной температуре, после чего сорбент пере носят на стеклянный фильтр. Несорби- рованный белок отмывают буфером с 2 М NaCl. Сорбированный белок десор- бируют 0,02 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,1, без NaCl. Концентрацию альбумина определяют измерением оптической плотности .растворов при 280 нм по калибровочной кривой.

Сравнительные данные концентрации лиганда и сорбционной емкости сорбентов, полученных по предлагаемому и известному способам.приведены в табл.I.

Примерб. В табл.2 приведены данные хроматографических испыта- НИИ сорбентов по предлагаемому и известному способам при выделении трипсина.

Условия испытаний: количество сорбента 1 г, колонка размером 8x120 мм буфер: 20 мМ трис-НС1, содержащий 2 мМ СаС и 3 М NaCl при рН 6,8.

1

С-80 Фенилглицидиловый 79,5 эфир

103,0

84,8

69,4

С-120 Фенилглицидиловый 122,3 эфир

МСА-1500 Фенол. 17,6

Бензиловый спирт 37,0 Бензиловый спирт 52-56 Октиловый спирт Дециловь1й спирт

л - 5 -

1286268

Десорбцию осуществляют линейным градиентом 3,0-0 К хлорида натрия. Скорость элюирования 15 мп/ч.

Формула изобретения

1.Способ получения сорбента для очистки ферментов и белков, включающий активирование макропористого кремнеземного носителя Г -глицидо- оксипропилтриэтоксисиланом с последующей обработкой гидрофобным ароматическим лигандом в присутствии эфира- та трехфтористого бора в среде диок- сана и промывкой продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения сорбционной емкости сорбента, в качестве лиганда используют фе- нилглицидиловый эфир.

2.Способ поп.1,отличаю- щ и и с я тем, что обработку лигандом проводят при соотношении 7-11 t лиганда на 10 г активированного носи- теля в 35-40 мл диоксана, содержаще-, го 0,7-0.,8 мл зфирата трехфтористого бора.

Таблица 1

32

38 32 32 51,0

9,6

8,8

2,4 1,8

Известный

Бензиловый спирт,конц, лиганда 56,3мкмоль/г 4,02

Фенилглици- диловый эфир, конц.лиганда 84,8 мкмоль/г 2,45

28,20 0,60 14,92 17,2 60,99 0,12 20,00 2,33 13,35

73,80 0,87 35,51 48,22 65,34 0,87 100,0 20,65 42,82

а б л и ц а 2

Изобретение относится к способу получения сорбента для очистки ферментов и белков и позволяет получить сорбент с повьтенной емкостью. Макропористый кремнезем по.следовательно- обрабатывают .Tf -глицидооксипропиЛ- триэтоксисиланом и фенилглицидиловым эфиром при соотношении 7-11. мМ эфира на 10 г модифицированного носителя. Вторую стадию проводят в диоксане в присутствии эфирата трёхфтористого бора. 1.3.П.Ф-ЛЫ, 2 табл. to 00 О Од 00