ы
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения об -галак- тозидазы генноинженерным путем.
Целью изобретения является повышение степени чистоты фермента.
Получение ct-галактозидазы, свободной от активности инвертазы, обеспечивается в результате клонирования фрагмента ДНК, кодирующего oi-галактозидазу. в вектор рВЕ 322, с последующим отбором нужных клонов ра питательной среде, содержащей ра- финозу, и культивированием штаммов бактерий - продуцентов конечного про дукта.
Пример I.-Из штамма Esche- richia coli BMTV 2743, DSM 2092, несущего DNA,.содержащую ген oi-галак- тозидазы, получают новый штамм с более высокой продуктивностью в отношении о,-галактозидазы.
Штамм Esclieric.hia coli BMTV 2743, Itnr, leu, thi, lac Y, tou A, raf, pets-лизоген), полученньш из E.coli K-12, BMTV 2744, DSM 2093, в течение 4 ч культивируют при 30 С и встряхивании в литре питательной сре- дь1, содержащей 1% триптона, 0,5% ,;; дрожжевого экстракта, 0,2% глюкозы и 0,5% хлористого натрия, и при рН 7,8, причем при достижении оптической плотности 0,5 OBeso (измерена при 650 нп) массу встряхивают 2 ч при 40°С до тепловой индукции чувс- ;вительного к температуре фагового рёпрессора. Из жидкой культуральной среды получают свободный фаг посред.- ством осаждения полиэтиленгликолем, после чего производят очистку при применении градиента плотности хлористого цезия. После экстрагирования фенолом и диализа по отношению к буферному раствору 10, мМ трис- HCI, рН 8,0) получают 0,6 мг очищен ного фага ВДА.
Для клонирования фрагмента Р1 raf DNA применяют ША плазмидный вектор pBR 322, который в качестве маркерных генов содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрагщклину.
Штамм Escherichia coli, содержащий пл змиду pBR 322, культивируют при встряхивании при 37 С в 1л питательного бульона до конца экспоненциальной фазы роста. Затем после добавления 150 мг/мл хлорамфеникола встряхивание продолжают в течение 15 ч при указанной температуре. При
этом плазмида накапливалась преимущественно в бактериях. После этого получают бактериальные клетки,, осу- с ществляют лизирование с лизоцимом и неионным детергентом. Лизат в течение 30 мин центрифугируют при нагрузке 48000 г с целью получения прозрачной жидкости. Из этой жидкости 0 с помощью двукратного центрифугирования при равновесном градиенте плотности при применении хлористого цезия и бромистого этидия, последующего экстрагирования фенолом и диализа 15 по отношению к буферному раствору (10 мМ трис-HCl, рН 8,0) получают 420 мкг плазмидной DNA.
По I О мкг Р1 raf DNA и векторной DNA обрабатьшают при З7 с в течение 20 1 ч эндонуклеазой Sal I для того, чтобы полностью расщепить молекулы DNA, а затем в течение 5 мин производят нагревание до 65°С.
После этого Р1 raf DNA фракциони- 25 руют с помощью электрофореза на О, агаровом геле. Фрагмент с относительным молекулярным весом четыре мегадальтон отделяют и после экстрагирования фенолом и диализа в 30 буферном растворе (10 мМ трис-HCL рН 8,0) получают в растворе.
Раствор полученного указанным способом фрагмента Р1 raf DNA смешивают с раствором расщепленного pBR.322 переносчика DNA и после добавления dATP. дитиозритрита и хлористого магния в течение 24 ч при 4°С подвергают воздействию DNA-лигазы фага Т4.
Обычный шламм Е. coli (BMTV 2744,
40 DSM 2093) при встряхивании культивируют в 50 мл питательного бульона при 37 С до конца экспоненциальной фазы роста. Клетки отделяют и суспендируют на бане со льдом в 50 мМ раст-
45 воре хлористого кальция.
Приготовленную суспензию смешивают с раствором peкoмбинaнtнoй DNA, смесь в течение 20 мин выдерживают на бане со льдом, а затем нагревают в течение 3 мин до 37 С. Клетки пересевают в питательньш бульон и в течение 45 мин производят встряхивание при 37 С, в результате чего полностью происходит реакция трансформа- 5 ции.Клетки отделяют, промывают и снова суспендируют. Небольшую часть суспензии клеток наносят на покрытую агаром пластину, причем агар содер35
50
3
жит на литр 10,5-г К2НР04, 4,5 г КН,Р04, 1 г (NH4)S04, 0,5 г цитрата натрия , 0,1 г сернокислого магния 7 , 1 мг тиамина, 2г рафино- зы, 25 г ампициллина и 15 г агара (рН 7,2), Пластину выдерживают при 37 С. После вьщерживания в течение 2 сут, на пластине появились многочис43
1681
. НИИ к белым составляет в первом случае 1:4, во втором случае - 1:3.
Красные колонии во всех случаях расщепляют рафинозу, т.е. в них все еще содержится целый raf-оперон. Белые клетки не обладают способностью расщеплять рафинозу. Однако, они все продуцируют фермент ci-галактозидазу.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения об-галактозидазы генноинжеиерньи путем. Цепью изобретения является повышение степени чистоты фермента. Получение oi-галактозидазы, свободной от активности инвертазы, .обеспечивается в результате клонирования фрагмента ДНК, кодирующего об-га- лактозидазу в вектор pBR 322 с последующим отбором нужных клонов на питательной среде, содержащей рафи- нозу, и культированием штаммов бактерий-продуцентов конечного продук- та. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.
ленные колонии. Все колонии собирают, 10 как показал тест в свободном от кле-
очищают и отделяют.
Каждая из полученных указанным способом колоний обладает способностью использовать рафинозу в качестве единственного источника углерода и одно- 15 нозы культивируют в питательном бульо.
временно была устойчива к действию ампициллина. Таким образом, они обладают иными свойствами по сравнению со штаммом, который бьш применен в качестве организма-хозяина.
Из полученных колоний в каждом случае вьщеляют плазмидную DNA.
Отбираю плазмиду из колоний, которые после обработки ферментом Есо R I или Hind III дают мень- щий второй фрагмент, чем плазмиды других колоний. Бактерии, которые несут эту плазмиду, могут использовать рафинозу в качестве единственного Источника углерода и производить все ферменты-оперона.
По 10 мкг DNA рВТ 100 из BMTV 2741 (DSM 2090) в течение 1 ч обрабатывают при 27 С либо эндонук- леазой Hind III или эндонуклеазой Есо R I с целью расщепления DNA- молекул. Затем в течение 5 мин производят нагревание при 65 С.
Раствор обрабатьшают таким образом плазмидной DNA, подвергают обработке Т4-лигазой.
Непосредственно после этого компоненты клетки штамма E.coli обрабатьшают -раствором ренатури11ованной DNA. Небольшую часть обработанных указанным способом клеток наносят на пластины Мае Сопсеу Paffincse (Difco Labaratories Detroit) с 25 мкг/мл ампициллина. На пластинах в случае трансформации плазмидной DNA обрабатывают предварительно с применением Hind III, после выдержки в течение 24 ч при 27 С образуется приблизительно 20 колоний, а на пластинах в случае трансформации DfIA, предварительно обработанной EcoRl, выявляют приблизительно 30 колоний. Соотношение красных коло- .
оне при 37 С до образования станцио- нарной фазы. Поэтому такие клетки обладают другими сввйствами по сравнению с организмом-хозяином или клет- 20
ками BMTV 2741 (BSM 2090), которые трансформированы с применением рВТ 100.
Плазмиду, которую после предшествующей Hind III обработки рВТ 100 по лучают на Мае Сопсеу пластинах в виде белых колоний, называют рВТ 101, а плазмиду полученную в результате предшествующей реакции с Есо RI, называют рВТ 102. Штамм E.coli с рВТ 102
30 называют BMTV 2742 (DSM 2091).
В табл. 1 представлены экспериментальные результаты испытаний свободного от содержания клеток экстракта на содержание о6-галактозидазы с
35 о1-ПМФГ после культивирования при 25 С BMTV 2742.- Клетки инкубируют в 10 мл питательного бульона в колбе емкостью :10% мл, после чего в течение 15 ч производят встряхивание при 30 С.Конт40. рольный опыт осущеставляют при культивировании исходного штамма BTMV 2743 в таких же условиях, но при добавлении к среде 0,2% рафинозы.
Как из таб. 1, экстракт штам45 ма BNTV 2742 в сравнении с BWV 2743 отличается значительно более высоким содержанием галактозидазы.
Штамм, №
50
Активность of, -галактозидазы, и/мг
EMTV 2742. (DSM)209l)
. BMTV 2743 .55 (DSM 2092)
10
0,4
мг растворенного белка в сырьевом экстракте.
ток экстракте с п-нитрофенил-о.-галак- тозидом {oi-ПНФГ) в качестве цветного субстрата, в том случае, когда клетки без предварительного добавления рафио.
оне при 37 С до образования станцио- нарной фазы. Поэтому такие клетки обладают другими сввйствами по сравнению с организмом-хозяином или клет-
ками BMTV 2741 (BSM 2090), которые трансформированы с применением рВТ 100.
Плазмиду, которую после предшествующей Hind III обработки рВТ 100 получают на Мае Сопсеу пластинах в виде белых колоний, называют рВТ 101, а плазмиду полученную в результате предшествующей реакции с Есо RI, называют рВТ 102. Штамм E.coli с рВТ 102
называют BMTV 2742 (DSM 2091).
В табл. 1 представлены экспериментальные результаты испытаний свободного от содержания клеток экстракта на содержание о6-галактозидазы с
о1-ПМФГ после культивирования при 25 С BMTV 2742.- Клетки инкубируют в 10 мл питательного бульона в колбе емкостью 10% мл, после чего в течение 15 ч производят встряхивание при 30 С.Контрольный опыт осущеставляют при культивировании исходного штамма BTMV 2743 в таких же условиях, но при добавлении к среде 0,2% рафинозы.
Как из таб. 1, экстракт штамма BNTV 2742 в сравнении с BWV 2743 отличается значительно более высоким содержанием галактозидазы.
Штамм, №
50
Активность of, -галактозидазы, и/мг
EMTV 2742. (DSM)209l)
BMTV 2743 (DSM 2092)
10
0,4
мг растворенного белка в сырьевом экстракте.
При соблюдении этих условий проведения опыта в известном штамме E.coli BMTV 2744 обнаруживалась активность : 0,001 и/мг,
Шт амм E.coli D 2091 обладает всеми свойствами, типичными для штаммов Е. coli.i
Морфология: палочки, отдельные или парные.10
Развитие: аэробное или факультативно анаэробное, оптимально при 37°С.
Другие характеристики: грам-отри- цательны,не спорробразугощая Оактерия, хемооргамотроф каталазо-позитивный , Ьксидазо-негативный.
Он содержит плазмиду рВТ 102, устойчив к ампициллину в концентрации 50 мкг/мл и внутриклекточно продуцирует об-галактозидазу, которая не нуждается в. присутствии дополнительных агентов, но не производит инвер- тазу. В остальном он не отличается от штамма Е. coli К-12 и может культивироваться при 37 С на стандартной среде, наиболее целесообразно при аэрации.
Формула изобретения 30
20
25
681
дук та,
отличающийся тем,
0
0
0
5
что, с целью повьпиения степени чисто- ты фермента за счет уменьшения содержания инвертазы, из штамма E.coli DSM 2092 выделяют ДНК, содержащую ген о -галактозидазы, расщепляют ДНК эндонуклеазой Sal I, вьщеляют фракции ДНК, несущие ген oi-галактозида- зы размером около четырехмегадаль- тон, после сшивают полученный фрагмент с расщепленным рестриктазой Sal I вектором pBR 322, содержащим ген устойчивости к ампициллину, в присутствии ДНК-лигазы фага Т4 при добавлении АТФ, дитиоэтрита и хлористого магния, полученную рекомбинант- ную ДНК инкубщ уют с клетками E.coli, трансформированные клетки культивируют на питательной среде, содержащей 2-10 г/л рафинозы, образовавшиеся устойчивые к ампициллину колонии отделяют и лизируют, из лизата вьщеляют плазмидную ДНК 6,9-12,4 мегадаль- тон, которую ращепляют .рестрикцион- ной эндонуклеазой Hidn III и о бра- батьшают ДНК-лгиазой, полученную ренатурированную плазмиду рВТ 102 суспендируют с клетками E.coli,трансформанты вновь культивируют на питательной среде, содержащей 2-10 г/л рафинозу и ампициллин, отбирают колонии Е. coli, использующие рафинозу, и получают целевой продукт культивированием этих клонов микроорганизмов..
2, Штамм бактерий Escherichia coli - DSM 2091 - продуцентoi-галактозидазы.
| Патент США № 3562113, кл.195-66, 1971. |
