Рекомбинантная плазмида @ 5 @ ,способ ее конструирования и штамм @ . @ @ 600 @ 5 @ -продуцент сайт-специфической эндонуклеазы @ п Советский патент 1987 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области }-шкро6иологической промышленности и молекулярной биологии и представляет -собой рекомбинантную плазмидную ДНК, оиределяющзпо высокоэффективньй синтез сайт-специфической эндонуклеазы, способ ее конструирования и штамм, несущий эту рекомбинактную плазмид- ну5о ДНК - продуцент сайт-специфичеС- ;кой эндонуклеазы Pvu.II. ; Целью изобретения является создание эффективного штамма продуцента эндонуклеаэ.ы Рлш 11, пригодного для быстрой очистки PTU II.

Поставленная цель достигается тем .что сконструирована рекомбинатная- шшзг-тда рВРЗШ, определяющая высо- кий уровень синтеза фермента Pvu II.,

Ш

J5

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК-плазмиды pBR 322 расщепляют ,зндонуклеазой Sal I, смешивают с -ДНК . из Proteus viilgaris, гидролизованной эндонуклеазой Xho I, и фрагменты вос- соединяю-f ДНК-лигазой фага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки Е, coll. и высевают на селективную среду с ампициллином. Из полученных клонов вьщеляют плазмидную ДНК, гид- ролизуют эндонуклеазой Рлт II и полученной смесью вновь трансформируют клетки E.coli , отбирают клоны, устойчивые к ампицшгаину, из которых выделяют рекомбинантные плазмиды.

Штамм - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы II, полученный

Способ конструирования рекомбииатной Q трансформацией плазмвды рВРЗЕМ в

плазг-гццы основан на гидролизе ДНК из Р. vulgarls- эндонуклеазой Kho I, ; встраивании полученных фрагментов в векторную ДНК с последующим клонированием в E.coli; и отбором рекомби- нантов, содержащих ген зндонук.леазы PVU 11,

: В .качестве шта№1а продуцента сайт-специфической эндонуклеазы Рлт II используют штамм « coli С600Р5Ш.

Рёкомбинантная плазмидная ДНК рВРЗРМ размером 9000 пар оснований содержит ген эндонукле азы. Pvu II и состоит из ДНК рВН 322 в которой по Sal I сайту встроен фрагмент ДНК, полученный при гидролизе дак из /Р, Tulgaris эндонуклеазой Xho I,

Фрагмент ДНК Р, rulgaris име.ет

25

35

штамм E.coli С 600,--.обеспечивает синтез эндонуклеазы Рлт II в количестве не менее 100000 ед. на 1 г сырого ве-; са клеток. Штагам t.coli С 600 Р5 Ш депонирован во Всесоюзной коллекции промьшленных микроорганизмов при BHHIi - Генетика под К В 3272,

Штамм .E.coli С 600 Р5 RM, содер- ж,зщий плазмиду pBPSRM, характеризуется следуюш:ш.1И признаками.

Морфологи ческие признаки; клетки прямые J. палочковидной формы 1,2--- 1,6 X 2,0 X буО мкм, подви;1Шые5 с пернтрихалы- Ь№1 жгутиками, грамотри- цательные.

Культуральные признакиs хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре колонии гладкие J, круглые, . прижаты

размеры 4700 пар оснований и содержит Q блестящие, серы.е, край ровныйj.MyT- ;гайты для эндонуклеаз С1а Is EcoPi I, ные При росте в жидк1-1х ср.едак, мясо- и Hind ЦТJ расстояния между к.оторы- пептонном бульоне, В бульоне образуют мн приведены в таблице,,ровную интенсивнузо муть..

Физиолого-бкохи1«шческие признаки: растут в пределах 10 - при оптимуме рН от б,.,, В качестве ис- точн1-жа углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности глюкозу, фруктозу, арабинозу, лактозу, галактозу. В качестве источника азота используют ми- неральнью.соли в аммонийной и нитратной форме, в органической форме - пептонэ ai OTHoкислоты, нитраты восстанавливают до нитритов.

Желатину не разжюкают. Уреазная а;ктивность не обнаруживается. Индол не образуют.

Xho I. - Cla I0,9

Cla I - Hind III0,2

Hind III -Hind ill1,8

Hind III -EcoR I,6

EcoR I - Xho I0,15

50

55

5

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК-плазмиды pBR 322 расщепляют ,зндонуклеазой Sal I, смешивают с -ДНК . из Proteus viilgaris, гидролизованной эндонуклеазой Xho I, и фрагменты вос- соединяю-f ДНК-лигазой фага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки Е, coll. и высевают на селективную среду с ампициллином. Из полученных клонов вьщеляют плазмидную ДНК, гид- ролизуют эндонуклеазой Рлт II и полученной смесью вновь трансформируют клетки E.coli , отбирают клоны, устойчивые к ампицшгаину, из которых выделяют рекомбинантные плазмиды.

Штамм - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы II, полученный

Q трансформацией плазмвды рВРЗЕМ в

5

5

штамм E.coli С 600,--.обеспечивает синтез эндонуклеазы Рлт II в количестве не менее 100000 ед. на 1 г сырого ве-; са клеток. Штагам t.coli С 600 Р5 Ш депонирован во Всесоюзной коллекции промьшленных микроорганизмов при BHHIi - Генетика под К В 3272,

Штамм .E.coli С 600 Р5 RM, содер- ж,зщий плазмиду pBPSRM, характеризуется следуюш:ш.1И признаками.

Морфологи ческие признаки; клетки прямые J. палочковидной формы 1,2--- 1,6 X 2,0 X буО мкм, подви;1Шые5 с пернтрихалы- Ь№1 жгутиками, грамотри- цательные.

Культуральные признакиs хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре колонии гладкие J, круглые, . прижаты

Устойчивость к антибиотикам: проявляют устойчивость к ампициллину.

П р и г е р 1, Конструирование рекомбинантной ДНК,

При конструировании рекомбинант- .ной плазмиды pBP5RM в реципиентную гшазмиду встраивают фрагмент ДНК Р. vulgaris. Ilпaзми нyю ДНК pBR 322 выделяют из штамма E.coli RRI, со- держагоего эту плазмиду 10 г биомассы E.coli RRI суспендировали в 20 мл 20%-ной сахарозы, 2 мМ MgCl, добавляли 10 мг лизоцима в 1 мл , инкубировали при . 5 мин, затем добавляли 0,25 М ЭДТА (рН 8,0) до конечной концентрации 40 мМ, инкубировали 10 мин при , добавляли 5 М NaCl до концентрации 1 М, 10% тритон Х-100 до 1% и оставляли на ночь при +4 С. Затем суспензию центрифугировали при 100000 g 3 ч, к надосадочной жидкости добавляли CsCl (0,8 г на 1 мл раствора), центрифугировали 30 мин при 5000 об/мин,- пленку белков на поверхности жидкости отбрасьгоали, добавляли бромистый этидий до

0,4 мг/мл, после чего раствор центрифугировали 36 ч при 50009 об. мин

на роторе 50,2 Ti. Зону, соответст- вующую сверхспиральной ДНК, отбирали, бромистый этидий экстрагировали изопропанолом;. плазмидную ДНК осаждали этанолом, осадок растворяли в 0,5 М WaCl и дополнительно очищали ДНК-хроматографией на колонке с Биогелем А-15. Фракции, содержащие ДНК, объединяли, ДНК осаждали добавлением 2 объемов этанола, осадок отделяли центрифугированием, растворяли в и в таком виде использовали в дальнейшем. ДНК Р. ailgaris вьщеля- ли после лизиса клеток лизоцимом,

. как описано выше, с последующей фе- нольной депротеинизацией. После об- работки фенолом водную фазу, содержащую ДНК диализовали против 0,01 М яатрий-цитратного буфера (рН 7,5), инкубировали 5 ч при 50 мкг панкреатической РНК-азы, затем вновь обрабатьюали равным-объемом фенола, последний затем из водной фазы удаляли диализом против 0,01 -М натрий- цитратного буфера. Полученные препараты ДНК Р. vulgaris и PE h 322 использовали для получения рекомбинантной плазмиды pBP5RM.-ДНК рВЕ 322 (1 мкг) и Р. vulgaris (З мкг), гидролизовали в буфере 100 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 10 мМ MgCl.j, 2 мМ дитиотре- ит соответственно эндонуклеазы Sal I и Х1-Ю I в течение 1 ч при 37 С, затем растворы смешивали, добавляли АТФ до концентрации 0,07 мкМ и 2 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Объем реакционной смеси 100 мкл, реакцию проводят при 16 ч, затем 1 ч при 37 С.

П ,р и М е р 2, Получение штамма- продуцента PVU 11

Для получения штамма-продуцента эндонуклеазы Pvu II смесь рекомби- нантных молекул ДНК, полученных после обработки ДНК-лигазой, трансформируют в штамм E.coli С 600, что позволяет использовать его в качестве хозяина, содержащего низкое количество неспепифических нуклеаз, по

сравнению с исходным штаммом Р. vulgaris. 50 мл.культуры E.coji СбОО подращивают до 2-3.10 кл/мл, осаждают при 6000 g 15 мин при О с, затем дважды промывают 25 мл 0,1 М

СаС и-ресуспендируют в 0,5 мл

того же раствора, К 12 мл ДНК, полученной после лигазной обработки, добавляют 25 мкл компетентных клеток. Смесь вьщерживают 20 мин при О С, затем 2 мин при 42°С и 10 , переносят в I мл среды, индкубируют 2 ч при с аэрацией. Суспензию высевают в 50 мл среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, выращивают до

поздней логарифмической фазы, клетки

осаждают центрифугированием и вьще:ляют из них сверхспиральную ДН.К, как

описано в примере 1, 5 мкг этой ДНК

обрабатывают 1 ч при 37 С 10 ед. эндонуклеазы Pvu IT, затем проводят

трансформацию, как описано вьш1е. После трансформации клетки инкубируют в 1 мл среды 2 ч и высевают на чашки С 50 мкг/мл ампициллина. Трансформанты отбирают по устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Клоны, удовлетворяющие этим условиям, высевают в 5 мл среды, выращивают до поздней логарифмической фазы,

клетки собирают центрифугированием и тестируют в них содержание эндонукле- азы Pvu II.

Пример 3. Тестирование кло- нов на содержание эндонуклеазы Pvu II проводили следующим образом. Клетки клона, выращенные в 5 мл среды, суспендировали в 1 мл 0,01 М калий-фос- . фатного буфера (рН 7,0), содержащего

0,1 М NaCl, и обрабатывали ультразвуком 3 мин при охлаждении льдом (амплитуда 8 мкм). Обломки клеток осаждали при 40000 g и в надосадочной жидкости определяли активность Pvn II, Аликвоты разводили от 1/5 до 1/200 и по 5 мкл из каждого разведения добавляли к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 100 мМ трис-НС1 (рН 7,8), 10 MgCl.j,, 0,5 мкг ДНК фага 5 инкубировали 30 мин при 37 37 Cj Продукты реакции анализировали электрофорезом в геле О„8% агаро- зы, гель окрашивали бромистымэтиди- ем и фотографировали при облучении УФ-светом. Фрагментация ДНК указьша- ла на наличие в клетках культуры эн- дон т леазы Pvu II«

Клоны в которых бьшо обнаружено

сти к ампициллиау, дает возможность стабильного культивирования клеток в процессе получения биомассы.

5 Форму л а изобретения

Рекомбинантная плазмида pBPSRM, кодирующая биосинтез сайт - специфической эндону1слеазы Pvu II, имеет

0 размер 9000 пар оснований и состоит из следующих элементов: EcoR I - Sal I - фрагмента плазмиды pBR 322, расстояния ме7кду сайтами 650 пар оснований, Xho I - Xho I фрагмента

5 ДНК Proteus vulgaris, содержащего ген эндонуклеазы Pvu ТГ,и сайты С1а I Hind III, Hind III, EcoR I, расстояние между которыми (от Xho I сайта) 900, 200, 1800, 1600 и 150 пар осноприсутствие эндонуклеазы Рлга 11, вы- 20 ваний соответственно. Sal I - EcoR I

рашдвапи в 1 л жидкой среды и определяли в них количество эндонуклеазы PVU II в стандартных условиях (гидролиз 1 14кг ДНК фага, в 50 мкл за I ч)о

Штамм E.col i С 600 F5 RM содержит фермента не менее 100000 ед, на I г биомассы Незначительное количество неспецифических нуклеаз дает возможность тестировать количество эндонук лаазы Рти II непосредственно в клеточном экстракте Тестирование Pvu II в исходном штаг-ме Р. vulgaris невозможно из-за неспецифических нукле-

донуклеазой Sal I, ДНК Proteus vul garis гидролизуют эндонуклеазой Xho полученные фрагменты соединяют действием ДНК - лигаэи, этой смесьюаз, они ке затрудняют очистку целево- 35 трансформируют E.coli, выделяют из

40

клеток плазми,цную ДНК обрабатьшают PVU IT, затем вновь трансформируют клетки E.colio среди трансформантов устойчивых к ампициллину отбирают клоны, oбecпeчивaюlIЦie синтез эндонуклеазы Pvu 11, из которых выделяют целевзто рекомбинантную плазмиду.

го продукта.

Таким образом, предлагае1-1ые объекты позволяют получить штамм Е„coll продуцент эндонуклеазы II, Уровень содержания фермента-в -предлага- емом штамме не менее 100000 ед,, на 1 г сырого веса клеток, отсутствует эндонуклеаза Pvu I, уровень неспеци- ,

фических эндонуклеаз значительно ни- 3, Штамм Escherichia coli С 600 же, чем в исходном штамме,, что суще- Р5 RM (коллекция центрального музея ственно ддя получения высокоочищен- иромьщшенных 1ушкроорганизмов инсти- ного препарата фермента. Рекомбинант- тута ВНИИГенетика, коллекционный нал плазмида рВРЗЕМ, несущая гель эн- номер В-3272) продуцент сайт - спе- донуклеазы Pvu II.и ген резистентно- цифической эндонуклеазы Pvu II,

Редактор И. Егорова

Составитель Н, Кузенксва

Техред А. Кравчук Корректоре, Черни

562/27

Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

сти к ампициллиау, дает возможность стабильного культивирования клеток в процессе получения биомассы.

Форму л а изобретения

Рекомбинантная плазмида pBPSRM, кодирующая биосинтез сайт - специфической эндону1слеазы Pvu II, имеет

размер 9000 пар оснований и состоит из следующих элементов: EcoR I - Sal I - фрагмента плазмиды pBR 322, расстояния ме7кду сайтами 650 пар оснований, Xho I - Xho I фрагмента

ДНК Proteus vulgaris, содержащего ген эндонуклеазы Pvu ТГ,и сайты С1а I Hind III, Hind III, EcoR I, расстояние между которыми (от Xho I сайта) 900, 200, 1800, 1600 и 150 пар оснований соответственно. Sal I - EcoR I

фрагмента плазмиды pBR 322, содержащего репликон плазмиды pBR 322 и ген, ответственньй за синтез бета-лакта- мазы (определ51ющий устойчивость к ампициллину),

2 о Способ конструирования плазмиды рВР5РМэ кодирующий биосинтез сайт- специфической зндонуклеазы, заключающийся 3 том, что ДНК плаз- 0 меды рВВ 322 расщепляют эн

донуклеазой Sal I, ДНК Proteus vulgaris гидролизуют эндонуклеазой Xho I полученные фрагменты соединяют действием ДНК - лигаэи, этой смесью35 трансформируют E.coli, выделяют из

40

клеток плазми,цную ДНК обрабатьшают PVU IT, затем вновь трансформируют клетки E.colio среди трансформантов устойчивых к ампициллину отбирают клоны, oбecпeчивaюlIЦie синтез эндонуклеазы Pvu 11, из которых выделяют целевзто рекомбинантную плазмиду.

,

Изобретение позволяет получить эффективный штамм-продуцент эндонук- леазы PVU II. Сконструирована реком.бинантная плазмидная ДНК pBP5RM, определяющая высокий уровень синтеза фермента Pvu II. Способ ее конструирования, состоит в том, что ДНК плаз- миды pBR322 расщепляют эндонуклеазой Sal I, смешивают с ДНК из Proteus vulgaris, гидролизованной эндонуклеазой. Xho I, и фрагменты воссоединяют ДНК-лигазой фага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки-Е.coll.и высевают на селективную среду с ампициллином. Из полученных клонов выделяют плазмидную ZpK, гидролизуют эндонуклеазой Pvu II и полученной смесью вновь трансформируют клетки E.coli. Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, из которых выделяют рекомбинантные плазмиды. Штамм E.coli C600P5RM - продуцент сайт - специфической эндонуклеазы Pvu II получен трансформацией плазмиды PBP5RM в штамм E.coli С 600. 3 с.п. ф-лы, 1 табл. с S (О ю со 4 00 1C