Рекомбинантная плазмидная ДНК @ ,способ конструирования плазмидной ДНК и штамм-продуцент эндонуклеазы рестрикции @ Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 C12R1/19 

2. Способ конструирования рекомбинантной ДНК plLPV8 i методом генетической инженерии, отличающийся тем, что, с целью.увеличения выхода эндонуклеазы рестрикции EcoRV, рекомбинантную плазмиднуш ДНК р1 L RV8 расщепляют эндоиуклеазой рестрикции Hind III, образующиеся фрагменты лигируют ДНК-лигазой фага ТА, полу.ченными кольцевыми мoлeкyлa &I ДНК

трансформируют клетки E.coli, лизогенные по фагу лямбда cl и из клонов, устойчивых к ампициллину, вьщеляют целевую рекомбинантную плазмидную . ДНК.

3. Штамм Escherichia coli. ВКМ Н-4Д (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) - продуцент зндонуклеазы рестрикции Есо RV.

1. Рекомбйиантная плазмидиая ДНК pl.LRVSa размером 8,4 тысяч пар оснований состоит из фрагментрв ДНК фага лямбда размером 1,73 тысяч пар оснований и плазмидиой ДНК рВ8 322 размером 4,0 тыся1 Пар оснований и содерл1гт ген бета-лактамазы, ген фага лямбда и иаходясщеся под контролем правого промотора ранних генов фага лямбда Р,- гены системы рестрикции и модификацш :Есо RVj определяет синтез .эндонуклеазы рестрикции Есо RV. 8SIS О СЛ О fit 1ЧЭ

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии и микробиологической промышленности и представляет собой рекомбинаптную плазмидпую ДНК, способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК,опреде ляющей повышенный синтез эндонуклеазы рестрикции Ес,о RV (К.Есо RV) и спосо конструирования стабильного штаммапродуцента зндонуклеазы рестрикции Есо RVj сохраняющего свои свойства п длительном культивировании. Фермент Р«Есо UV используется в молекулярной биологии как в экспери ментах по конструированию рекомбинантных ЛНК in vitro, так и при изу чении первичной структуры ДНК; Известен способ получения рекомбииантной плазмидной ДНК pILRV8, которая содержит гены системы реетрикции-модификации EcoRV, находящиеся под контролем промотора фага . лямбда Pj , Уровень транскридции с этого промотора регулируется термочувствительным репрессором С1, ген которого локализован в этой же плазмиде. Плазмидная ДНК plLRVS сконструирована с использованием фрагмента ДНК фага лямбда размером 2,5 тысяч пар оснований (тпо) и содержащего область иммунитета з-того фага.. Недостатком сконструированной плазмиды plLRVB является ее относительная нестабильность при индукции экспрессии Р.Есо RV. Известен штамм-продуцент Р.Есо R Escherichia coli ВКМ В-1455 Д. Уровень активности R.Eco RV в бесклеточном экстракте белков этого продуцента - ISIO ед/г биомассы 1. Недостатком сконструированного штамма является относительная его нестабильность, резко возрастающая с повьпиением температуры кзльтивирования свьше 37°С, что сказывается на конечном вьссоде фермента. В связи сэтим необходимо проводить культивирование штамма, содержащего плазмидную ДНК, в диапазоне температур 30-34°С. Однако максимальнре увеличение синтеза фермента достигается повьшением температуры до 43С при достижении клетками средней логарифмической фазы роста. Уровень актив,нести -р.Есо HV в этом штамме недостаточно высок, изобретения является увеличелие выхода фермента R.Eco RV. , Поставленная цель достигается тем, что сконструирован делеционньгй вариант рекомбинантной плазмидной ДHK.plURV8 , названный p1LRV8/j размером 8,4 тысяч пар оснований, которая состоит из. фрагментов ДНК фага лямбда размером 1,73 тысяч пар оснований и плазмидной ДНК рВЕ 322 размером 4,0 тысяч пар оснований и содержит ген бета-лактамазы, ген rex фага лямбда и ггаходящийся иод контролем правого промотора ранних генов фага лямбда (. гены системы рестрикции и мрдификации Есо RV, определяет син эндонуклеазы рестрикции Есо SV, Поставленная цель достигается также тем, что согласно способу конструировапия рекомбинантной ДНК p.ILEv8d методом генетической инженерия, рекомбинантнуто плазмидную ДНК

р1LBV8 расщепляют,эндонуклеазной рестрикции Hind III, образующиеся фрагменты лигируют ДНК-лигазой фага Т4, полученными кольцевыми молекулами ДНК трансформируют клетки 5 E.coli, лизогенные по фагз лямбда и из клонов , устойчивых к ампициллину, вьделягот целевую рекомбинантную- плазмидную ДНК.

Поставленная цель достигается fo также тем, что используют штамм E.coli ВКМ К-4Д (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР), в котором плазмидная ДНК p1L,RV8d максимально стабильна и обеспечива- f5 . ет наибольшую экспрессию Р.Есо RV.

Рекомбинантная плазмидная ДНК, plURVSi размером 8,4 тпо (схема плазм1вдной ДНК pILRVSil представлена на фиг,1) содержит наряду с ге- 20 ном .лактамазы, определяюдим разистентность клеток к а-х :циллину, находя1циеся под контролем промотора фага лямбда Р гены системы рестрикции-модификации Есо RV и представля- 25 ют собой ДНК ptLRVS с делецией по Hind III сайтам в области генов

фага с1 и

Сущность способа конструирования зо предлагаемой плазмиды plLRV84 состоит в том, что ДНК плазмиды piLPVS

расщепляют,эндонуклеазой Hind III и после обработки ДНК-лигазой фага

ТД, кольцевыми молекулами ДНК gr трансформируют клетки E.coli, лизогенные по фагу Л с1 и отбирают клоны по признаку устойчивости клеток к ампициллину.

Отбор клеток, содержащих plLRVSi 40 может быть осуществлен с помощью любого лабораторного штамма Escherichia coli, лизогенного по фагу Л например, E.coli К802 (Л); E.coli

СбОО (Л); E.coli НВ101 (А); E.coli 45 .W 3350 (Л), С 5183 (Л).

Из отдельных клонов вьщеляют индивидуальную плазмидную ДНК.

Е качестве контроля используют трансформацию клеток E.coliJ €5183, 50 нелизогенных по фагу лямбда, такие клетки делеционными вариантами плазмид не трансформируются (фиг.2).

Штамм-продуцент эндонуклеазы рестрикции Есо RV получают трансфер- 55 мадией плазмидной ДНК pjLRV8u штамм E.coli J C5183/(pLG13, pLGIA) . В этом штамме плазмидная ДНК

максимально стабильна и обеспечивает повышенный синтез фермента припостоянной температуре культивирования (фиг.2).

Штамм E.coli J С5183, содержащий плазмиды p1LRV8d, pLG13 и pLG14j депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ R-4 Д.

Шта№- E.coli ВКМ R-4Д характеризуется следзюп1и ш признаками.

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковзадной формы 1,2-1,6; 2,0; .6,0 мк, подвижные, с перитрихиальнымя жгутиками, грамм-отрицатель ые, неспороносные.

Культуральные признаки. Хорошо растут нд простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре Дифко колонии гладкие, круглые, прижатые, блестяпр е, серые, край ровный, мутные, При росте в жидких средах: мясо-пептонном бульоне, в LB-бульопе образ тот ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки. Растут в пределах 4-45°С при оптимуз-1ё рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода использ тст многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: оС-глюкозу, ed-фруктозу, 1алактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу, не усваивающ1 й ацетат, аданит.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной л нитратной форме, так и в органической форме и в виде пентона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают, Уреазная активность не обнаруживается. Индол не образуют.

Устойчивость к антибиотикам. Проявляет устойчивость к ампициллину.

Генетические признаки штамма: К Есо Kif Есо :ес ее ; sbcB, F, , ien 6, pro A2, his 4, thi 1, arg Ej, lac 41, gal K2, ara 14, xyl 5, met-l, tsx-33.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pILRVSd.

Плазмвдную ДНК p1LRv8 вь;г1еляют из штамма ВКМ В-1455 Д по методу (Clewell, Helineky, 1969, PNAS, 62, 1159-1163).

2 мкг вьщеленной ДНК гидролизуют pecтpиктaзoйHind III в 100 мкл раствора, содержащего 5.0 tM трис-НСС , рН 7,8, .10 мМ MgCl2 , 2 мМ 2-меркапт этанола, 20 мМ NaCl при 37°С 1 ч. После прогревания реакционной смеси при 65°С в течение 10 мин проводят кольцевание фрагментов ДНК-ДНК1лигазой фага Т.4 в присутствии АТФ (100 мкМ) при концентрации ДНК 0,5 мкг/Мл (+10°С, 14 ч). Смесью об разовавшихся модекул трансформируют клетки E.coli J С5183 (jicl). Получение компетентных клеток штамма и ,трансформацию проводят по методу (Cohen S.M., Chang А.С.Х., Нац R., Proc.Natl.Acad. Sci., USA 69, 2110-2114, 1972). Селекцию клонов, содержапщх плазмиды, проводят на. твердой агаризованной среде в присутствии 30 МКГ/МЛ ампициллина при . Из выросших колоний выделяют . индивидуальную плазмидную ДНК ускоренным методом щелочного лизиса (Birnboim Н.С.., Doly J. Nucl. Acid Res., 7, 1513-1523, 1979) и вьщелен ной пЛазмидной ДНК трансформируют клетки штаммов E.coli J С5183 и E,co1i); С5183 (Лс). Плазмидные ДНК, способные трансформировать лизогенные штаммы E.coli J С5183 ( Л cl) с частотой не менее 10 кол ний/мкг плазмидной ДНК, не трансформирующие клетки штамма E.coli J С5183, используют для дальнейшего анализа, Рестрикционный анализ проводят с помощью эндонуклеаз рестрикции Bg III, Pst 1, Hind III. Среди тран сформантов отбирают ДНК типов содержащих, по одному участку узнавания для энДонуклеазы Hing III и по два участка узнавания для этой эидонуклеазы рестрикции. Размеры фрагментов ДНК, -образующихся при рестрикционном анализе, представлены в таблице. Плазмидн то ДНК с наибольшей делецией (потеря обоих Hind III фрагментов 0,560 тпо и 0,125 тпо), названную p1LRv8/l, используют для получения штамма-продуцента эндонуклеазы рестрикции Есо RV. Плазмидная ДНК plLRV8A, схема которой показана на фиг.1, имеет обнщй размер 8,4 тпо, состоит из у гастков ДНК лямбда (1,73 тпо), плазмидной ДНК pBR 322 (4,000 тпо) и содержит гены системы рестрикции и модификации Есо Rv, ген беталакта мазы, определяющий резистентность клеток к ампициллину, правый промотор ранних генов фага :лямбда Р,. и ген этого фага Лр„, (Matr К., Schmandt М., Gussin С.М. Geneties., 102:319-327, 1982). Делеционная инактивация гена репрессора С1 в составе плазмидной ДНК plLRVRd приводит к полной инактивации гена репрессора С1,соответственно, к дерепрессии транскрипции с промотора Р и увеличению уровня синтеза эндонуклеазы рестрикции Есо PV. АBg Il-Pst 1,31,3 В.Pstl-Psti 3,83,8 СPstl-PstI 1,61,6 DBglll-Hindlll 1,2 . 1,2 EHind-Pstl 0,2 FPstl-Hind III 0,36 GHindlll-Hindlll 0,13 HHindlll-Bg III 0,520,52 9,08,4 - размер фрагментов в тпо. Пример 2. Конструирование штамма Escherichia coli ВКМ R-4Д. Клетки штамма E.coli J С 5183/: (pLG 13, pLG 14) (Glatman L. e t al. VII, International colloqiura on Laboratory methods for epidemiological surveillance p.22, Wernigorode DDR, 1981) подращивают до титра 2-3 г 10 клеток/мл, затем собирают их центрифугированием при 6000 15 мин при , суспендируют в равном объеме О,1 М CaClg,. выдерживают при не менее 1 ч, повторно осаждают клетки -при 6000 0°С и суспендируют в 0,1 М CaCPj в десятой части исходного объема (компетентные клетки) . . 1 мкг ДНК P1LRV84 в 50 мкл раствора 10 M трис-НСе , рН 8,0, 1 мМ ЭДТА смешивают с 100 мкл компетентных клеток, инкубируют 20 мин во / льду, затем 2 мин при и 10 мин при комнатной температуре, добавляю 1,3 мл LB-бульона и инкубируют 2 ч при с интенсивной аэрацией. Суспензию высевают на агаризованную среду с 30 мкг/мл ампициллина (100 мкл/чашку Петри). Схема получе ния штамма .представлена на фиг.2. Анализ штамма Escherichia coli ВКМ-Р-4Д. Из отдельных выросшие колоний вы деляют индивидуа льную плазмидную , ДНК и по 1 мкг используют для повто ной трансформации клеток E.coli J С 5183 ( Лс1) и E.coli JC5I83. Селекцию клонов, содержащих рекомби нантную плазмиду p1LRV8/J, проводят по резистентности клеток к ампициллину (30 мкг/мг). Стабильность фенотипа, определяе мого piLRVBu, изучают в клонах, ДНК которых трансформирует E.coli J С5183 (ДсГ) с частотой 0,5-ЫО а штамм E.coli J С5183, нелизогенный по фагу лямбда с частотой 1-5 г Ю. Клетки отобранных клонов инокулируют в 10 мл бульона LB и растят при 37°С с усиленной аэрацией до ранней .стационарной фазы (2-310 клеток/мл /50-тыо мкл клеток заражают повторно to мл LB. Процедуру повторяют еще раз (всего 3 цикла). На завершающем этапе делают серийное разведение культуры и высевают на чашки с агаризованпой ив-средой, не содержащей антибиотика. При проверке 500 колоний на наличие маркера резистентности к-ампициллину и способности ограничивать бактериофаг Д vir. О показано, что утери сцепленных с плазмидой pILRVBd генетических маркеров не происходит. Частоты трансформацией лизогенного и нелизогенного штаммов E.coli J С5183 плаз. мвдными ДНК, вьщеленных из десяти н зависимых клонов этой серии частот, обычно равно 20:1, что характерно для передачи несцепленных признаков Следовательно, плазмидные ДНК p1LRv84, PLG 13, pLG 14 ведут се,бя как отдельные структурные единицы. Сконструированный штамм E.coli ВКМ К-4Д обеспечивает стабильное поддержание плазмиды pILRVSA во вре мя длительного культивирования в не.селективных условиях. Это свойство 02 определяется наличием в штамме - продуценте плазмидпои ДНК pLG 13. В штамме ВКМ R-4Д прозеряют уро- вень синтеза R.Eco HV при постоянной температуре культивирования . Культуру подращивают в 1 л среды до 5-10 клеток/мл. Клетки осаждают центрифугированием при 6000 15 ьшн, и 0,9 г (сьфой вес) биомассы суспендирук1Т в 6 мл буфера, содержащего 50 мМтрис-НС, рН 7,6;0,2 М NaCl, 3 мМ2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл лизоцима и вьщерживают при 40 мин Клетки разрушают ультразвуком, экстракт получают центрифугированием при 2°С (48000). Активность R.Eco SV определяют в серийных разведениях супернятанта: 1/100; 1/500; 1/1000-, 1/5000; 1/25000; 1/50000, t мин ДНК фага лямбда инкубируют в 30 мкл инкубационной смеси (5 мМ трис-НС 1 }v рН 7,6; 50 мМ NaCl; 10 мМ. MgCl,.,; 6 мМ 2-меркаптоэтанола) с 2 нкл из каждого разведения. Уровень активности эндонуклеазы рестрикции Есо IIV в бесклеточном экстракте.- штамма ВКМ и-4Д около 2040 ед. в пересчете на 1 г биомассы. Таким образом, плазмидная ДНК pILRVSd, содержащая промотор ран11их генов фага лямбда и гены рестрикциимодификации Есо RV, определяют повышенньй синтез R.Eco B.V, не зависящий от температуры культивирования клеток ВКМ Е-4Д. - Предлагаемый способ конструирования рекомбинантпой плазмидной ДНК обеспечивает повьшгенный синтез ре- стриктазы Есо RV за счет транскрипции с промотора Р , под контролем которого находятся гены системы .ре- стрикции-модификации Есо в составе плазмидной ДНК. Эффективность транскрипции с последнего не зависит от температуры культивирования. Штамм E.coli ВКМ Е-4Д как продуце)1т специфической эндонуклеазы Есо RV обеспечивает повьш1енный уровень содержания фермента не менее 20-25-10 ед на 1 г сырого вещества биомассы клеток, что в 1,7 раза ревосходит уровень синтеза R.Eco RV в клетках E.coli ВКМ В-1455 Д. Этот ровень достигается без температурой индукции при культивировании. штамме E.coli ВКМ В-4Д наблюдается табильное поддержание плазмидной НК p1LRV84, что позволяет культиви9 - 113060210

ровать его в больших (полу-пригодным для использования промышленные установки).как в лабораторных условиях, Таким образом перечисленныетак и на промьшшенных устасвойства штамма делают его .новках.

HindJH -. {/„, Ralir / BgiS Sglir

PsiJ

plLRVB

Pstl

us,2