Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения креатйнамидиногидролазы в штаммах бактерий Escherichia coli и Pseudomonas putida.
Цель изобретения - получение штам мов, конститутивно продуцирующих креатинамидиногидролазу.
Выделяют ДНК из Pseudomonas putida, расщепляют эндонуклеазой EcoRI с выделением фрагмента размером 5,8 кВ, обрабатывают его эндонуклеа- зами EcoRI и PvuII и получают фрагмент размером 2,2 кВ, который клонируют в расщепленный вектор, трансформируют в соответствующий E.coli и Р.putida.
Пример. Выделяют хромосомную ДНК Pseudomonas putida DSM 2106 после
разрушения клеток, наматывания ДНК на стеклянную палочку после двух обработок фенолом и осс1ждения этанолом, растворяют ее в концентрации 600 /Уг/мл.
10 Ц г хромосомной ДНК обрабатывают 5 единицами EcoRI и анализируют степень переваривания в агарозном геле,
ю бактерий штамма E.coli ED DSM 2102 инкубируют в присутствии 5-10 Д фагов Шарон 10 в течение 20 мин при 37°С и затем оставляют для роста до начала лизирования бактерий в 500 мл полной среды с последующим выделением фага,
10 гиг Шарон 10 ДНК полностью расщепляют 1 мг EcoRI эндонуклеазы, разрезанную хромосомную ДНК Pseudoсд ю со о ел ел
О4
tnonas putida инкубируют с 3 г рас щепленного эндонуклеазой EcoRI ДНК фага Шарон 10 с 40 единицами фермента Т4 ДНК лигазы. Упаковку связанных ДНК-фрагментов головные и хвостовые протеины фага / производят в пробирке. Около 0,5 Ц г связанных и Pseu- domonas ДНК инкубируют посредством исходной смеси ,в упаковке в пробирке через 60 мин добавляют 0,5 мл SM буферного раствора, 1/200 объема (2,5 (цл) исходной смеси в упаковке инкубируют при помощи 200 л выдержанного в течение ночи штамм E.coli (в lO молярном сульфате магния) 10 мин при 37°С, Суспензию бактерий смешивают затем с 3 мл LB-агарозы :(0j8%) и вьшивают на-ЪВ пластины. На 1 ГЦ г введенной ДНК получают около 15 фаговых отверстий (тромбоцитов),
Для идентифицирования фагов, которые содержат кодирующий креатиназу ген, применяют иммунотест с фермен- том. Индикаторная система состоит из 6 мг/мл тетраметилбензидина, 20 мг/мл диоктилнатрийсульфосукцината и 0,01% в желатине. На 1000 тромбоцитов устанавливают два положительных сигнала.
Из пяти положительных в иммуно- , тесте с ферментом тромбоцитов полу чают препарат фагов -ДНК„Расщепление пяти различных ДНК посредством EcoRI позволило выявить ДНК-полосу во всех пяти фагах ДНК 5,8 кВ.
Приблизительно 5 ill г этого EcoRI- фрагмента расщепляют при использовании PvuII эндонуклеазы и вьщеляют фрагмент размером 2,2 кВ.Образующиеся фрагменты ДНК разделяют в низкоплавком геле агарозы по их размеру, и выделяют фрагмент EcoRI - PvuIIа Выделение ДНК фрагментов из низко- плавких гелей агарозы производят вырезанием соответствующих полос, переводом в пробирку (трубочку Эппендорфа) и смешиванием приблизи тельно с двухкратным объемом воды, затем инкубируют при до тех пор (от 5 до 10 мин)р пока не расплавится агароза, пробу встряхивают в течение короткого времени и потом интенсивно встряхивают с половиной объема фенола (нейтрализованного 10 ммол ТРА-НС1 .с рН 7,5 и 1 мм ЕДТА .ТЕ), Фазы разделяют центрифугированием за 10 мин при 15000 g и верхнюю водную фазу снова экстрагируют встря
5
0
5
0
5
0
5
0
5
хиванием с фенолом. После центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g верхнюю фазу дважды экстрагируют путем встряхивания с простым эфиром (по I мл), простой эфир выпаривают при 65 С и дак осаждают при помощи 1/10 объема 3 М ацетата натрия с рН 7,2 и 2,5-кратного объема этанола при 20°С. ДНК осаждают центрифугированием за 10 мин при 15000 g, сушат в вакууме и вводят в 10 |ил ТЕ,, Все описанные дальше выделения фрагментов производят аналогично.
Около 4 Ц| г pBR 322 ДНК расщепляют посредством EcoRI и PvuII и выделяют фрагмент размером 2,3 кВ. 0,2 /иг этого pBR 322-фрагмента инкубируют в течение ночи в присутствии пяти единиц Т4 ДНК лигазы и 0,5 |Ur EcoRI - PvuII-фрагмента размером 2,2 кВ из описанных- Л фагов. Полученную плаз МИДУ называют рВТ-3-2, она кодирует в E,coli биологически активную креатиназу.
Пример 2. Фрагмент ДНК, кодирующий креатиназу из плазмиды рВТ-3- 2, обрабатывают нитрозогуанидином, Выделяют плазмидную ДНК после лизиро вания клеток при помощи метода CSCI- этилбромида. Клетки штамма E,coli ED 8654 трансформируют при помощи плазмидной ДНК и помещают на пластинах полной средЁ (LB)., содержащих 20 Й4Г/мл ампициллина. После инкубации в течение ночи при на ЬВ-пластины помещают нитроце-шцолозную фильтровальнзпо бумагу. После инкубации в течение ч при 37° С нитроцеллюлозный фильтр с ко- лониями снимают и переводят в стеклянт ную чашку Петри (ш20 см), в .которую был добавлен 1 мл смеси хлороформа с толуолом (1:1), Инкубацию проводят за 20 мин при 37°С, Затем нитроцеллюлоз ньй фильтр накладывают на индикаторную агарозную пластину таким образом, чтобы возникал прямой контакт между клетками и индикаторной пластиной .
Цветная реакция происходит в зависимости от времени и количества сиитези рованной в отдельных клонах креатина зы. Из описанной системы фильтрования вьщеляют клон ЕД с .плазмидой рВТ , DSM 3143« Эта плазмида кодирует креатиназу, которая составляет около 50% растворенного протеина клеток.
Как альтернативу к описанному прямому ЫС-мутагенезу увеличение уровня
51523
экспрессивности креатиназы можно достигнуть с помощью lac-npoMOTopa (последний можно вьщелять из имеющихся в продаже плазмид, например pUC- плазмид). Для этого плазмиду рВт-3-2 обрабатьшают EcoRI-эндонук-, леазой, обрабатывают эндонуклеазой Bal 31 таким образом, что удаляют около 10-100 вр с. каждой стороны. Затем 1ас-промотор при помощи фермента Т4-лигазы, связьшающего концы, вводят в укороченную плазмиду ВТ 3-2. Эту ДНК мутагенизируют с нитрозогуани- дином, после этого применяют для трансформации штамма ED и клоны испытывают на высокую экспрессивность гена.
Упомянутая индикаторная агарозная пластина представляет тест-систему для отбора активности, принцип которой состоит в том, что креатин расщепляют ферментами креатинамидиногидрола- зы и Сарказиноксилазы на образования Н,0 через пероксидазу в 1/2 0 и и осуществляет реакцию кислорода с. системой цветного индикатора, например, из 4-аминоантипирина (4ААН) и N-этил-N-(сульфоэтил)-3-метиланилина,. соли EST. Образуется голубовато-фиолетовое окрашивание, которое при избытке ферментов сарказиноксилазы и перокси- дазы представляет степень синтезиро-. ванной в колониях креатинамидиногидро- лазы.
Изобретение касается генетической инженерии, а именно получения креатинамидоногидролаза в штаммах бактерий ESCHERICHIA COLI I PSEUDOMONAS PUTIDA. Целью изобретения является получение штаммов, конститутивно продуцирующих креатинамидиногидролазу. Выделяют ДНК из PSEUDOMONAS PUTIDA, расщепляют эндонуклеазой ECORI, фрагмент размером 5,8 кв обрабатывают эндонуклеазами ECORI и PYUII и получают фрагмент размером 2,2 кВ, который клонируют в расщепленный эндонуклеазой вектор, трансформируют в штамм E.COLI DSM 2102 и P.PUTIDA DSM 2106. 2 табл.
Тест-принпдп:
креатинамидино-
Креатин + гидролаза саркозин + мочевина
Загс - CD,
Саркозин + 0(2 + HgO глицин + формальдегид +
POD
4-ААР + EST
35
Состав системы фильтрующей активности креатинамидиногидролазы показан в табл.1.30
Указанные в пунктах 1.-7 реактивы растворяют и смешивают с одинаковьм объемом низкоплавкой агарозы (2%), 6 мл выливают в чашку Петри, пластины можно хранить около 2 недель при в темноте.
Пример 3 Для клонирования и обеспечения экспрессивности клонированной креатинамидиногидролазы в дО
Pseudomonas putida применяют плазмиду RSF 1010. RSF 1010 линеаризируют посредством Pstll и из плазмиды рАСУС 177 после НАЕ11 - расщепления вьщеляют
1,4 кВ-фрагмент, 0,2 |Цг RSF 1010 ДНК дд связьшают с 1 /и г Нае 11-фрагмента при использовании Т4-лигазы, получаю
щаяся плазмида представляет собой рВТ 306,1 RSF 1010 и производные этой плазмиды отличаются широким диапазономjg хозяина и пригодны, например, для Pseudomonaden и E.coli, Плазмиду рВТ 2а-1 расщепляют посредством Pvul и
PvuII, вьщеляют 2,8 кВ-фрагмент. - рВТ 306,1 плазмиду расщепляют посред- ее ством Pvul и Smal и выделяют фрагмент размером 10 кВ. 0,5 (U г векторной дак связывают с 0,5 (Ц г Pvu I-Pv,uII- фрагмент.а. E.coli ED трансформируют
краситель + 2Н20
5
0
О
д
и идентифицируют кодирующие креатиназу клоны при помощи отбора активности на пластинах. Из одного из положительных клонов получают по методу с С8С1-этш1- бромидом плазмидную ДНК. Плазмида имеет название рБТ 306,16, DSM 3149 Р.
Трансформируют-плазмидную ДНК в Pseudomonas putida 2440,
При помощи фильтрования с отбором активности на пластинах идентифицируют положительные клоны. Это возможно у Pseudomonas putida 2440, хотя этот штамм содержит хромосомнокодированную креатинамидиногидролазу, так как экспрессивность кодированной плазмидной креатинамидиногидролазы проявляется структурно. Этот отличительный признак позволяет проводить различие между кодированной хромосомой и кодирован- ной плазмидной креатинамидиногидрола-
ЗОЙ.
Пример 4. Определение актив- ности креатинамидиногидролазы произ водят обнаружением образованных в результате реакций с уреазой ионов аммония с тест-комбинацией мочевина
Дикий тип Pseudomonas putida 2440 для определения активности креа- тинамидиногидролазы инкубируют при в течение ночи в В-среде (5 мл), которая содержит 1% креатина.
Клетки собирают центрифугированием и промывают один раз в 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 7,5. Клетки в первоначальном объеме вводят в фосфатньй буферный раствор (50 мМ с рН 7,5) и растворяют обработкой ультразвуком (4)сЗО с).
Выращивание и растворение клеток, которые содержат плазмиду, кодирующую креатинамидиногидролазу, проводят опИ санным способом, с тем исключением, что среда не содержит креатина для индукции и что отбирают с добавкой ампициллина (20 jUr/мл для плазмиды рВТ ) или стрептомицина (20 шг/мл для плазмиды рВТ 306.16). Рост культур происходит для Pseudomonas puti- da при 30° С5 для Ebdol.i - при 37 С.
Данные показывают, что в результа те. клонирования креатинамидиногидро лазы в E. coli бактерии получают новое свойство синтезировать креатинамидиногидролазу и эта экспрессивность в противоположность исходному штамму Pseudomonas putida проявляется струк турно как для E.coli, так и для Pseudomonas putida. Благодаря мутагенезу ДНК, кодирующих креатинамидиногидро лазу, можно достигнуть особенно высокой экспрессивности
. В E coli ЕД/рВТ 2А-1 DSM 3143 активность составляет 500 ед./г биомассы (влажной) 5. удельная активность 4,5 ед,/мг протеина Так как удельная активность высокоочищенного протеина составляет 9 ед./мг это означает, что креатинамидиногидролаза в E.coli составляет 50% растворимого протеина. Анализ сырого экстракта в показьшает, что креатинамидиногидрола за представляет основную полосу фрак ции растворимого протеина.
50
Пример 5. Ддя культивирования.« в ферментере применяют три различных .системы хозяина Eecoli, а именно E.coli W 3350, E.coli ЕД 8654 и E.ccli CHI Ппаэмиду рВТ трансформируют в соответствующие компетентные клетки. Отдельнь с колонии культуры выращивают в DYT-среде, которая содержит 20 jyr/i-in ампициллина, в течение ночи при . Ферментационную среду (DYT) засевают предварительной культурой (инокулят 1%) и без отбора на содержание плазми-- - ды оставляют на ч при 37 С для- роста. Активность креатинамидиногидро- лазы после 25 ч инкубирования состав
0
5
0
5
30
35
40
50
.« - -
ляет около 600 ед/г сырой массы или 4,5 ед./мг протеина.
Плазмиду рВТ 306.16 трансформируют, в клетки Pseudomonas putida штамма 2440, причем получают Р. putida DSM N3147.
После очистки отдельных колоний инкубируют культуру в DYT-среде, которая содержит 200 Кг/мл стрепто мицина при 30°С в течение ночи. Ферментационную среду (ДУТ) засевают (инокулят 1%) и оставляют культуру для роста на 20-30 ч при 30°С, Активность после 25 ч составляет около 220 ед./г сырой массы, активность 1,8 едо/мг протеина Формула изобретения
Способ получения щтаммов бактерий Escherichia coli и Pseudomonas putida - продуцентов креатинамидиногидролазы, заключающийся в том, что хромосомную ДНК из Pseudomonas putida DSM 2106 и ДИК фага Шарон 10 обрабатывают эндонуклеазой Eco. RI, лигируют полученные фрагменты, упаковывают гибридные ДНК в присутствии протеинов оболочки фага, трасдуцируют полу ченными гибридными фагами клетки E.coli DSM 2102, которые предвари- тельно обрабатывают в течение ночи 0, раствором мальтозы и растворяют в 0,1 М/л MgSO, далее идентифицируют фаги, зкспрессируюшде креатинамидиногидролазу с помощью индикаторной системы, содержащей 6 мг/мл тетра- метилбензидина, 20 мг/мл диоктилнат- рийсукцината и 0,01% , в 6%-ной желатине, выделяют фаги, дающие положительную реакцию, ДНК этих фагой об-( рабатывают эндонуклеазой Eco.RI с последующим выделением фрагмента размером 5,8 кВ, которые обрабатывают эндонуклеазой PvuII, выделяют Eco.RI PvuII - фрагмент размером 2,2 кВ, который лигируют с расщепленным Г EcOoRI и PvuII вектором pBR 322, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют клетки бактерий E.coli DSM 2102, отбирают клетки, конститутивно .продуцирующие креатиназу, полученные клетки обрабатывают 25 мг/мл нитрозе- гуанидином, выделяют плазмидную ДНК,. которой т зансформируют клетки E.coli DSM 2102, отбирают бактерии, содержащие плазмиду рВТ 2а-1, полученной плазмидной ДНК трансформируют E.coli DSM 2102 и обрабатывают ее
эндонуклеазами Pvul и PvuII, вьщеля- ют фрагмент, размером 2,8 кВ, которьй лигируют с фрагментом Pvul - Smal размером 10 кВ вектора рВТ 306,1, полученного в результате обработки плазмиды pSE 1010 и лигирования с
Таблица
Креатинамидиногидролаза в Pseudomonas putida и E.Coli
05510
фрагментом 1,4 кВ Haell плазмиды рАСУС177, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют клетки P.putida DSM 2440 и выделяют клоны, конститу тивно продуилрующие креатинамидино- гидролазу.
Т б .a..
| Archivesof Biochem and Biophys, 1977(1976), 508-515 | |||
| US № 4420562, кл | |||
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
