Способ культивирования микроорганизмов-продуцентов L-лизина Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 C12P13/04 

СО

(Х ND

СО

СП

HloOpflTCIHK РТНПСИГСГ к ГПП ,рО()ИП-логячес к о Г; каг жггсп спосюбя культяпиропяиия микрооргяниз- мор г. иг.пользованнем г,инт тнческ1гх пеиогасителей и может быть использо-- пяио при 6HocnFfTP4e L-лнэииа.

Целью изобретения является удешевление процесса.

Способ осупхествлягот следующим об-- разом.

Микроорганизмы вь рал1инают ггри аэ-- рации на питательной среде, в которую добавлена стерильная эмульсия поли- пропиленглчколевого эфира, например,, пропкнола Б-АОО, стабилизированная омьшенкым зкиром в количестве 0,2- 1,0 мас.%.

Омыление животного или микробного лшра проводят 40%-ным водным раство- ром гидроокиси калия или натрия при в течение 1-1,5 ч в зависимости от вида жирового сырья при перемешивании реакционной массы. .

Стерильную эмульсию вносят в та- ком количестве, чтобы содержание по- липропилеигликолевого эфира в питательной среде составило 0,015-0,15%,, В процессе культивирования стериль- нукз эмульсию добавляют в периоды уси ления вспенивания порциями, содержащми 0,0002-0,02% полипропиленгликолев го эфира от объема среды.

П р и м е р 1. Осуществляют биосн тез лизина с помощью культуры микроо ганиэма Brevibacterium sp.22L в ферментере емкостью 100 м . Выралщваиие микроорганизма ведут в 50 м стериль- ной гштательной среды, содержащей 10 т (20% к объему) свеклосахарной мелассы; 1 м (2%) кукурузного экстракта; 5,3 м (10,6%) ферментализата BBKj 0,9 т (1,8%) хлористого аммония 55 кг (0,11%) двузамещенного фосфата аммония и 30 кг (0,015% пропино- ла Б-400 к объему среды) 25%-ной эмульсии пропинола Б-400, стабилизированной омыленным рыбьим жиром в коицеитрац ш 0,5 мас.%.

Эмульсию готовят следующим обра- зом.

В реактор с мешалкой загружают 3 т воды и 20 кг омыленного рыбьего яира. После полного растворения ста- Силз1затора в реактор добавляют 1т полипропиленгликолевого эфира-пропилена , смесь перемешивают и про пускают через диспергирующее устрой- стпо. Получают 4020 кг 25%-ной эмульсии пен И ягителя, стябиличиропамной 0,5 м;и: , % , nMiri.iiRMHOfo рыбьрг о жнра. Определяют устойчивость пмульсии к коп.лг.спенции путем иеитрифу1 И зопя- ния ее п церп рифуге при 000 об./мин в течение 15 мни. Вег1 1чину устойчивости в npoiieHTax ряссчитывпют по формуле

V .

. 100%,

где V - объем полипропиленгликолевого эфира в эмульсии, У - объем выделившейся фазы,

см

Для данной эмульсии X 99%. После стерш изации паром при в течение 2 ч эмульсию используют для добавления в ферментер. Величина устойчивости эмульсии после стерилизации X 95%.

Омыление рыбьего жира проводят следующим образом.

В реактор, снабженный тихоходной мешалкой и греющей рубашкой, загружают рыбий жир с числом омытения 178,2 мг КОН/Г в количестве 25 л и добавляют рассчитанные по числу омыления 5,1 л 40%-ного водного раствора едкого натра. Щелочной гидролиз ведут при 80-85 С в течение 1,5 ч при периодическом перемешивании. Процесс прекращают при достижении реакционной массой рН 8.

В качестве посевного материала используют 24-часовую культуру продуцента в количестве 5 м , выращенную на питательной среде с 4% мелассы, 7% кукурузного экстракта, 1% хлористого аммония.

Ферментацию проводят в айептичес- ких условиях при 30-32 с, непрерывной азрации и перемешивании сжатым воздухом в количестве 1 м /мин на 1 м культуральной жидкости, при рН среды в пределах 7,3-7,5; давлен1-ш в аппарате 0,2-0,3 ати. Регулирование пе- нообразования осуществляют путем добавления в ферментер из колб стерильной эмульсии пеногасителя порциями по 0,4 л (0,0002% пропинола Б-400 от объема среды) в периоды резкого усиления вспенивания. Процесс биосинтеза ведут 59 ч. Получают 50 м культуральной жидкости с содержанием лизина 32,5 г/л. Выход биомассы 36 г/л.

Суммарный расход стабштизированной эмульсии пропипола Б-400 пл операцию

гост;шил 298 л, что в пересчете мл собстпемно пропипол Б- 400 составляет Ik, кг.

П р и м е р 2, Осугаествляют биосинтез лизина с помощью культуры микроорганизма Micrococcns glutamicuin fr 95 D ферментере емкостью. 100 услояиях, аналогичных описанным в примере 1.

В питательную среду до стерилизации вводят 300 кг (0,15% пропинола Б-400 от объема среды) 25%-ной эмульсии пропинола Б-400, приготовленной следующим образом.

В реактор с мешалкой загр тгают 3 т воды и 40 кг омыленного микробного жира. После полного растворения стабилизатора в реактор добавляют 1 т пропинола , смесь перемешивают и пропускают через диспергатор. Получают 4040 кг 25%-ной эмульсии пропинола Б-400, стабилизированной 1 мас.% омыленного микробного жира. Устойчивость данной эмульсии составляет , После стерилизации паром, как в примере 1, устойчивость эмульсии равна и ее используют для добавления в ферментер и внесения в питательную среду,

Омыление микробного жира проводят следующим образом.

В реактор, снабженный .тихоходной мешалкой и греющей рубашкой, загру- жают микробный жир с числом омыления 179,2 кг КОН/Г в количестве 20 л и добавляют рассчитанные по числу омыления 4,5 л 40%-ного водного раствора едкого кали. Щелочной гидро- ЛИЗ ведут при 80-85°С в течение 1,5 ч при периодическом перемешивании. Процесс прекращают при достижении реакционной массой рН В,

Ферментацию ведут как указано в

примере 1, регулируя пенообразование добавлением в ферментер по трубопроводу стерильной эмульсии пропинола Б-400, стабилизированной омыленным микробным жиром, порциями, содержащи 0,02% полипропиленгликолевого эфира от объема среды. Продолжительность ферментации 64 ч. Получают 49 м куль туральной жидкости с содержанием лизи на 34,2 г/л. Выход биомассы 40 г/л. Суммарный расход стабилизированной эмульсии пропилена Б-400 на. операцию составил 250 л, что в пересчете на

,

СОбсУГГ Пр.ЧП Чп;; - lOl.) (.-ОГТ;Ч Ч |(--;62,. -j Ki-;

Fl р и м е р, Ч. Ocyiuec ri j;4 ; f Ппо- г.нптея липинп с тюмощьрт ку. микрос1П а11пзмп lU twibncLefi iini яр. E-53I р ферментере с;мкост.ч1 100 м м теченг е 72 ч, как опистмо и примрро 1. В питательную среду до стсрилпзп 1И вводят 100 л (0,08% пропчнола (-. от объема среды) 40%-пой змулт сии пропинола Б-400, стаСшлизирочлмнон омыпе шым рыбьим жиром в количестве 1 мас.%. Омьше(ие рыбьего жира .и при- готопление эмульсии гтроводпт по примеру 1. Устойчивость исходной эмуль- суш , после стерилизации устойчивость эмульсии .

Пеногатение на режиме осуществляют путем подачи в ферментер данной стерильной эмульсии порциями, содержащими 0,008% пропинола от среды, .Получают 52 м культуральной жидкости с содержанием лизина 35,4 г/л. Выход биомассы 36 г/л. Суммарный расход стабилизированной эмульсии на операцию составил 166 л, что п пересчете на пропинол Б-400 составило 70,5 кг,

П р и н е р 4, Осуществляют биосинтез с помощью культуры микроорганизма Brevibacterium sp. Е-531 в ферментере емкостью 100 м в течение 69 ч, как описано в примере 1. В питательную среду зводят 300 кг (0,15% пропинола Б-400 от. объема среды) 25%-ной эмульсии пропинола Б-400, приготовленной следующим образом. .

В реактор, снабженный мешалкой, загружают 3 т воды и 10 кг сорбита- ля С-20 и перемешивают систему до полного растворения стабилизатора, В другой,реактор, снабженньв мешалкой и греющей рубашкой, загружают 1 т про- пипола Б-400. и 10 т сорбитана С, представляющего твердое вещество. После нагревания и перемешивания до полного растворения сорбитана С про- пинол Б-400 передавливается в первый реактор, смесь перемешивается и пропускается через диспергатор. Получают 4020 кг 25%-ной эмульсии пропинола Б-400, стабилизированной 0,5 мас.Х смеси сорбитана С-20/сорбитана С.Устойчивость эмульсий , после стерилизации ,

Пеногашение на режиме осуществляется путем подачи данной стерильной эмульсии в ферментер порциями,со5i.i lH.DS

С1,П, л. 1Г1к) J-j- iOO отмере 2 путям д(15лп;им)ия F3 рсрмеятер

мГп.емл г,1)глм. Tln.iiy tnKvi S6 м кулг-ту-цп трубопроводу стерильной эмульсии

рлпъиои жнл.к()сти с сл. дертчлнием лизи-пеиогасителя. По окончании фермептана U , 5 г/л. Выход Гп омассы 38 г/л.цни ппрел,елпют содержпние лизина и

Суммприк-й рпстсод пмульсии H;I опера-кулг.-туральной жидкости и выход биоп.ию составляет З (0 л, что в пересче- .массы, а также расход пеиогасителя на

те на пропннол состэ.о. 85кг.пеногашение. Данные по культивироваПолучркные результаты приведены вsij-no продуцентов лизина с использоватабл,1.10кипм эмульсии по табл.2 приведены в

Как видно из-таб тицы, при ис.поль-табл.3. . зевании в качестве стабилизатора

эмульсии полипрогпшент ликолевого эфи- Анализ табл.2 и 3 показывает суг ipa, например пропинола Б-АОО, омьшен-ществекное преимущество омыленных жи- IHbtx жяроп, имеет место повышение по 15ров по сравнению с мылом как стабили- сравнению с: иэвестньм способом устой-заторов эмульсий полипропиленгликоле- чивости гзмульсин при одинаковой кон-вых зфиров. При использовании омылен- цр.нтрации стабилизатора.ных жиров сокращается время приготовПример ы 5-10. Осуществляютления эмульсин, получаются эмульсин Гп осинтез лизина с помощью культуры 20с меньшим, чем в случае с хозяйствен- микроорганизма Brevibacterium sp.ным мьшом, размером капель, а следова- , либо другой культуры в фермен-тельно и с большей их численной кон- тере на питательной среде, как описа-центрацией. Это приводит к возраста- no п примере 1. В качестве пеногасите-нню пеногасящей эффективности и, как ля используют 25%-ные эмульсии пропи- 25следствие, к снижению расхода пенога- нола В-400 или полипропиленгликолево-сителя. Последнее, как видно из дан- го эфира спиртов фракции С-р-С,со,ных табл.3, благоприятно влияет на средней мол. м. 1000, стабилизирован-рост культуры и биосинтез лизина. Кро- ные омыленным рыбьим или микробнымме того, в О1 1ыленных жирах имеет мес- лсирон и для сравнения мьшом хозяйст-- 30то сочетание свойств компонентов, по- венным.зволяющее получить устойчивые, эмуль- Эмульсию готовят следующим образом.сии полипропиленгликолевых эфиров. В реактор с мешалкой загру т;ают 3т

; воды и 20 кг стабилизатора эмульсииФормулаизобретеиия I и фиксируют время его полного раство- 35

; рения. После полного растворения ста- Способ культивирования микроорга- билизатора в реактор добавляют 1 тнизмов - продуцентов L-лизина, пре-. пеногасителя, смксь перемешивают и ,дусматривающий приготовле ше питатель- пропускают через диспергирующее уст--ной среды и эмульсии пеногасителя из ройство. После перемешивания отбирают 40полипропиленгликолевого эфира со ста- пробу эмульсии для определения сред-билизатором, добавление ее в питатель- него диаметра капель, а затем по хо-ную среду, засев и последующее проведу диспергирования проводят отбордение процесса ферментации с контро- проб для дисперсионного анализа.лем уровня пенообразования и дробной

Устойчипость эмульсии до и после -45подачей эмульсии пеногаснтеля, о тстерилизации определяют, как в приме-л и ч а ю щ и и с я тем, что, с

ре 1.,целью удешевления процесса, в качестРезультаты определения параметровве стабилизатор а используют животные

эмульсий с различными стабилизаторамиили микробные жилы, которые предвари(содержание пеногасителя в эмульсии 50 тельно омыляют при 80...85 с в тече25 об.%) приведены в табл;.2. ние 60...90 мин до установления

Ферментацию проводят в асептичес--рН 8, при этом эмульсию готовят из

Kifx условиях при 20-32°С, непрерывнойрасчета содержания в ней омьшенных

аэрации и перемешивании сжатым воз-жиров 0,2...1 мас.% и в питательную

духом в колич( 1 м /мин на 1м 55QP AV вводят из расчета 0,015культуральной жвдкости, при рН среды0,15 мас.% полипропиленгликолевого

а пределах 7,3-7, 5 и.п.авлечии в аппа-эфира от объема среды, а дробную по рате 0,2-0,3 ати. Регулирование пенс-J ;a4y ведут из расчета 0,0002образовзнич осущестйлметсл, как в при-о 02 мас.%.

tj

in да

го

vD

Изобретение относится к микробиологической промыпшецности и касается способа культивирования микроорганизмов с использованием эмульсий пеногасителей, включающих полигфопи- ленгликолевьв1 эфир, стабилизатор и воду, и может быть использовано при биосинтезе лизина. Целью изобретения является удешевление процесса. Способ заключается в том, что в качестве стабилизатора используют омыленные животные и микробные жиры в количестве 0,2-1% от массы эмульсии. Получаемую стабильную эмульсию полипропилен- гликолевого эфира, например пропино- ла Б-400, вводят в питательную среду в количестве, содержащем 0,015-0,15% пеногасителя от объема среды, а за- о тем в периоды усиленного пе нообразова- ния стер ильиую эмульсию подают порци- /Л ями, содержащим 0,0002-0,02% пенога- Y сителя от объема среды. 3 табл. VMM

1Г|

f

Ch

а

о о

г

04

о о

1Л

см

о

«

о

00 го

со

1Л

м ™

п

«л

со

г4 4 VO

v

о со ««г

.-Si

м m

сх «о

и см М г

ф

4J О ОО

rt ю дэ П

1-1 Ы

5) . м о.

PQ Л

Brevibacterium

I 38235

12 Таблица 3