Способ получения @ -лизина Советский патент 1985 года по МПК C12P13/08 

ел vj

сд

:0 Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению незаменимой аминокислоты L-лизина, используемой в качестве добавки к кормам для животных и птицы. Известны способы получения L-лизина путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода, минеральные соли и необходимые аминокислоты, при периодическом добавлении в процессе культивирования питатель ной среды, со тержащей источники треонина, и других необхо димых при биосинтезе лизина веществ с последующим вьщелением L-лизина из культаральной жидкости. Время на чала добавления дополнительных питательных веществ (подпитки), необходимых для роста биомассы и биосин теза L-Лизина, определяют по отклонению от необ содимого уровня рН культур ал ьной среды .О, концентрации редуцируюрщх веществ ряду других показателей. Однако эти способы не обеспечивают стабильность процесса биосинтеза L-лизина вследствие того, что указанные показатели не учитывают содержание компонентов, определяющих биосинтетическую активность L-лизина, ростовых аминокислот, содержание которых значительно колеблется в различных источниках сырья. Наиболее близким к предлагаемому является способ получения L-лизина путем глубинного культивирования ег продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, мине ральные сопи, ростовые аминокислоты в условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования (стерильньк водных растворов мелассы и моче вины), причем раствор мелассы внося при снижении РВ в культуральной жид кости до 4,0 - 7,5 % и раствор моче ны - начиная с 24-го часа культивирования СзЗ . Однако известный способ не обесп чивает стабильных показателей при биосинтезе L-лизина и они колеблютс в широких пределах (уровень накоппения лизина 46-75 г/л в течение 72-96 ч). Это связано с тем, что азпссотрофные мутанть - продуценты лизина, лишь при тталичии ростовых аминокислот в среде активно растут и при их утилизации рост культуры прекращается и начинается синтез лизина, Ксли л период прекращения роста культуры и нач;ша активного синтеза внести в среду какой-либо источник ростовых аминокислот, то культура начнет перестраиваться на синтез биомассы, а это связано с торможегшем биосинтетических процессов. Таким образом, способ подачи в ферментапионную среду, например, раствора мелассы, содержащей наряду с углеводами ростовые аминокислоты, при определенной концентрапии в среде редупирующих веществ (углеводов) не обеспечивает стабильных показателей при биосинтезе лизина. Цель изобретения - повышение концентрадаи лизина в культуральной жидкости при одновременном сокращении продолжительности биосинтеза. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения L-лизина, вюшчающему глубинное культивирование продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода, минеральные соли, ростовые аминокислоты, в условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования с последуюгдам выделением лизина из культуральной жидкости, питательную среду добавляют при остаточном содержании треонина в среде 0,03-0,08 г/л. Активный синтез лизина начинается после утилизации значительной части ростовых аминокислот и, в частности, треонина. Причем максимальная скорость биосинтеза лизина достигается при сравнительно низкой удельной скорости роста культуры, которая зависит от остаточного содержания ростовых аминокислот в среде, В случае же полной утилизации ростовых аминокислот удельная скорость роста культуры приближается к нулю и скорость биосинтеза лизина при этом снижается. Максимальная скорость биосинтеза лизина соответствует невысокой концентрации ростовых аминокислот и, в частности, треонина в пределах 0,03-0,08 г/л. Таким образом, начало внесения подпитки, содержардей наряду с углеводами ростовые аминокислоты, обеспечивяет высокие показатели при биосинтезе лизина. При известном же способе начап подачи подпитки в зависимости от концентрации углеводов в среде не представляется возможным по отмече ным причинам. Невозможно также пол чить стабильные показатели биосинт за лизина. Способ осуществляется следующим образом. ПродуцирующиеL-лизин гомосерин завирящие микроорганизмы вьфащиваю в лабораторных условиях в колбах н качалке, а затем в посевном фермен тере емкостью 1 м при непрерывной аэрации и перемешивании при 30-32 рН 7,0-7,4 в течение 14-24 ч с использованием питательной среды сле дующего состава, г/л: Меласса (с концентрацией РВ 46-48%) 80-100 L- Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,14-0,18 L-Метионин (источником является гидролизат БВК) 0,04-0,06 МН(|.С1 (источником является нейтролизат ВЕК)8-9 NH4.H2.,04-0,06 Мел технический 8-10 Пропинол Б-400 0,15-0,2 Дпя биосинтеза Z-лизина посевно материал с концентрацией биомассы 9-11 г/л в .количестве 0,4-0,5 м п редают в ферментер емкостью 15м .проводят ферментацию в аэробных усл виях при расходе воздуха 0,7 1,2м/мин на 1 м среды при 3032°С, рН среды 7,2-7,6 на питательной среде следующего состава, г/л: Меласса (по РВ 46-48%) 135-140 L-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,26-0,32 L-Метионин (источником является гидролизат БВК)0,08-0,12 NH4.HiP040,8-1,0 NH4.C1 (источником является нейтролизат БВК)16-20 Мёл технический 5-8 Пропинол Б-400 0,15-0,20 Начальный коэффициент заполнения ферментера 35-43%. При достижении уровня треонина-в среде 30-80 мг/л начинают произво594дить подачу дополнительной питательной среды по 300-400 л через каждые 2-3 ч следующего состава, г/л: Меласса (с концентрацией РВ 46-48%)500-600 L-TpeoHHH (источником является меласса и гидролизат БВК) 0,20-0,22 Ь-Метионин (источником является ггвдролизат БВК)0,08-0,12 NH4Hj P04.0,8-1,0 NH Cl20-25 Пропинол Б-4000,15-0,20. Подачу питательной среды заканчивают при коэффициенте заполнения ферментера 0,7-0,8. В процессе подпитки концентрацию РВ в ферментационной среде поддерживают 3-5%, а биомассы 18-22 г/л. По окончании процесса ферментации культуральную жидкость стабилизирут, затем упаривают и высушивают до влажности 8-10%. Пример 1, Продуцент L-лизина Corynebacteium glutamicum Т-3 вьфащивают снаала на агаризированной питательной реде, а затем в колбах (750 мл) на ачалке (250 об/мин) при 30-32°С в 0 мл питательной среды следующего остава, г/л: Меласса (с концентрацией РВ 46%)8 L-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,15 L-Метионин (источником является гидролизат БВК) 0,045 (источником является нейтролизат БВК) 8 Ш4.%Р04 0,6 Мел технический 8 Пропинол Б-400 0,15 Затем выращивание 0,5 м посевого материала продолжают в посевном ерментере емкостью 1 м с испольованием питательной среды следующео состава, г/л: Меласса (с концентрацией РВ 46%)8 L-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,15 L-Метионин (источником является ггздролизат БВК) 0,045 ШфС1 (источником является нейтролизат БВК)8 NH4.HiP04.0,6 Мел технический 8 Пропинол Б-400 0,2 В процессе получения посевного материала в ферментере поддерживают расход воздуха 1 м/мин на 1 м среды, рН среды 7,0, температура греды 30°С, Полученный посевной материал с концентрацией биомассы 9 г/л в количестве 0,5 м передают в ферментер емкостью 15 м, в котором проводят основную ферментацию,. Исходньй состав питательной среды в ферментере (с учетом компонентов посевного материала) следующгта, г/л: Меласса (с поддержанием 46% РВ) 133 L-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,28 L-Метионин (источником является гидролизат БВК)0,09 .P041 NH),C1 (источником является нейтролизат БВК)17 115 5 15 20 25 3Q 0596 Мел.технический 5 Пропинол Б-400 0,2 Начальный коэффициент заполнения ферментера (с учетом посевного материала) 0,3%. В начале процесса ферментации поддерживают расход воздуха 0,7 м/мин на 1 среды, рН среды 7,2, температура среды 30 С, По истечении 10 ч ферментации расход воздуха увеличивают до 1,2 м/мин на 1 м среды и поддерживают рН 7,4, После внесения посевного материала отбирают пробу из ферментера и определяют начальную концентpaIlJ ю треонина методом газожидкостной хроматографии, которая равна 300 мг/л. По истечении 6 ч от начала культивирования определяют остаточное содержание треонина в культуральной жидкости, которое равно 150 мг/л. Затем по предварительно построенной табл, 1, отражающей потребление треонина продуцентом лизина в данных условиях культивирования, исходя из остаточного содержания треонина, определяют время, при котором остаточная концентрация треонина в ферментационной среде достигнет 0,06 г/л. Это время равно 9 ч.

а п

V

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ-L-ЛИЗИНА, включаюп й глубинное культивирование продуцирук)П1их его микроорганизмов на питательной среде, содержащей исг точники углерода, минеральные соли, ростовые аминокислоты, в условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования с последующим выделением лизина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения концентрации лизина в культуральной жидкости при одновременном сокращении продолжительности биосинтеза лизина, питательную среду добавляют при оста(Я точном содержании треонина в среде 0,03-0,08 г/л.

S

0)

5

ф

5

3

с5

о ,

§

А

и

о

f .

.5

о

04 Через 9 ч после начала ферментации начинают подавать подпитку по 300 л через каждые 2 ч следующего состава, г/л: Меласса (с концентрацией РВ 46%) L-Треонйн (источни- ком является меласса и гидролизат БВК) L-Метионик (источником является гидролизат БВК) МНфНгРО Пропинол Б-400 В процессе подпитки концентрацию РВ в ферментационной среде поддерхмвают 3,5%. Подача подпитки обеспечивает поддержание биомассы на уровне 18 г/л. При достижении коэффициента заполнения ферментера 0,7 подачу подпитки прекращают и в среду вносят 1 г тиамина и 0,5 г дистибиотина, К 55-му числу ферментации в культуральной жидкости накапливается L-лизина на уровне 48,5 г/л, что составляет 37,2% от потребленного сахара. Культурапьную жидкость стабилизируют добавлением соляной кисло- д ты до рН 4,5 и 0, бисульфитом натрия, затем упаривают, смешивают и высушивают до влажности 8%. Пример 2. Посевной материал продуцента L-лизина Brevibacterium f lavuin выращивают как в примере 1. . Биосинтез L-лизина проводят в условиях аналогичных примеру 1. Концентрация L-треонина в ферментационной жидкости перед началом ферментации равна 0,28 г/л. Через 8 ч от начала ферментации остаточное содержание треонина в ферментационной жидкости достигает уровня 0,14 г/л« По табл. 1 по известным концентрациям треонина 0,28 и 0,14 г/л находят время, при котором концентрация треонина в ферментационной жидкости равна 0,08 г/л. Это вре1зд равно tt ч от начала процесса ферментации. Через 11 ч начинают подачу подпитки состава, указанного в примере t, К 67-му часу ферментации в культуральной зкидкости накапливается 5S L-лизина на уровне 48 г/л, что со.станляет 38,7% от потребленного сахара. .се на эт в те 6 на на ре тр ту Lстха ли ра га Пример 3. Вьфапр1вание поного материала и биосинтез лизипроводят согласно примеру 1. При м начальное содержание треонина ультуральной жидкости при биосине лизина равно 0,32 г/л. После ферментации содержание треониравно 0,17 г/л. Согласно табл. 1 ало подачи подпитки проводят че10 ч, когда остаточная конценция треонина достигает 0,03 г/л. К 56-му часу ферментации в кульальной жидкости накапливается изина на уровне 47 г/л, что совляет 35,7% от потребленного саа. В табл. 2 представлены показатепри биосинтезе лизина серии опеий, проведенных согласно предламому способу. Таблица 2 Corynebacteriura glutamicutn Brevibacterium flavum Е-541

Пр одолжение табл,2

Из табл, 2 видно, что накопление лизина в культуральной жидкости происходит до концентрации 44,2 А8 г/л за время 53-58 ч продуцентом лизина Corinobacterium glutamicum Т-3 и до концентрации 44,5-48,2 г/л за 64-68 ч продуцентом Brevibacterium flavum Е-531. За время культивирования достигается высокий стабильный выход лизина по сравнению с известным способом, использование которого в промьшшенных условиях, например, на Шебекинском биохимическом заводе, дает выход лизина 25-35%.

Предлагаемьй способ по сраьнению с известным позволяет обеспечить вое 5 производимость высоких показателей при биосинтезе лизина: концентрации лизина в культуральной жидкости 44,2-48,1 г/л , при использовании культуры Т-3 и 44,5-48,5 г/л - для куль0 туры Е-531, время биосинтеза 55-58 ч для культуры Т-3 и 64-69 ч - для культуры Б-531.

По сравнению с базовым объектом, j используемым на Ливанском биохимическом заводе, выход лизина от потребленного сахара увеличился с 3234 до 35-38%, конценчфации лизина в культуральной жидкости выросла от 0 37-39 до 44-48 г/д, время ферментации сократилось от 70-75 до 6469 ч при использовании культуры Е-531 .