Штамм бактерий ВRеVIвастеRIUм LастоFеRмеNтUм-продуцент лизина Советский патент 1993 года по МПК C12N1/20 C12P13/08 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению лизина микробиологическим путем с помощью нового штамма-продуцента вида В.lactofermentum. Лизин широко используется в народном хозяйстве - медицине и пищевой промышленности, сельском хозяйстве.

Известен штамм-продуцент лизина B.tactofermentum НИТИА-88, синтезирующий до 62 г/л лизина. За время применения штамма в крупномасштабном производстве лизина на Чаренцаванском ОПЗ Лизин в течение двух лет были выявлены три бактериофага, лизирующие культуру BJactofermentum НИТИА-88: BIA 1. BIA 2 и В (A3. Подверженность штамма-продуцента лизису этими фагами приводила к снижению выхода лизина в ферментерах, что отрицательно сказывалось на экономических показателях завода.

Поэтому целью изобретения является создание на основе штамма В.lactofermentum НИТИА-88 нового продуцента, устойчивого ко всем выявленным в промышленных условиях фагам и не уступающего по активности родительскому штамму.. .

Штамм-продуцент В.lactofermentum НИТИА-88К получен на основе штамма BJactofermentum НИТИА-88 путем многоступенчатой селекции по следующей схеме:

Штамм В.lactofermentum НИТИА-88

отбор спонтанных, устойчивых к фагу BIA 1 мутантов и выбор варианта с наибольшей лизинпродуцирующей активностью.

Штамм BJactofermentum НИТИА-88-1 отбор спонтанных мутантов, устойчивых к фагу BIA 2 и выбор варианта с наибольшей лизинпродуцирующей активностью.

in С

х|

00 О)

о

Штамм B.lactofermentum НИТИА-88-2

отбор спонтанных му- тантов, устойчивых к фагу BIA 3 и выбор варианта с наибольшей лизинпррдуцирующей активностью.

Штамм B.lactofermentum НИТИА 88R.

Отбор фагоустойчивых вариантов проводят на чашках с агаризованной питательной средой одновременным высевом фага в титре не менее 10 фаговых частиц/мл и суспензии бактериальной культуры. Установлено, что частота возникновения спонтанных мутантов, устойчивых к фагам BIA 1, BIA 2, BIA 3 у штамма B.lactofermentum НИТИА-88 высокая (на уровне , 2- и 5 соответственно). Поэтому бактериальную суспензию наносят на чашки в титре 105 - 10е кл/мл. Выросшие колонии на каждом этапе селекции после трехкратной проверки на устойчивость к фагу проверяют на лизинпродуцирующую активность. : Штамм B.lactofermentum H1/1THA-88R депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером В-5453.

Морфологическая характеристика штамма B.lactofermentum НИТИА-88Н.

Клетки штамма B.lactofermentum НИ- THA-88R овальные, спор не образуют, неподвижные, окрашиваются по Граму. При росте на твердой синтетической среде на четвертые сутки образует колонии кремового цвета диаметром 1,5-2 мм, на агаризованной мясо-пептонной среде на вторые - третьи сутки образует колонии кремового цвета диаметром 2-3 мм. При посеве штрихом на вторые сутки наблюдается умеренный рост культуры. Суспензия клеток в бульоне и физиологическом растворе равномерная, без поверхностной пленки и осадка.

Физиолого-биохимические свойства. Штамм аэробный, хорошо растет при температуре 29-35° и имеет оптимум рН среды для роста 7-8:

Отношение к источникам углерода. Утилизирует глюкозу, сахарозу, лактозу, манно- зу, ксилозу, уксусную кислоту, этанол.

Отношение к источникам азота. Использует нитраты, мочевину, соли аммония, аминокислоты.

Штамм эуксотрофен по серину и лейцину, нуждается для роста в витаминах биоти

не и тиамине, устойчив к 5-2-аминоэтил-1 - цистеину.

Отношение к фагам. Штамм устойчив к фагам BIA 1, BIA 2 и BIA 3, выделенным в

крупномасштабном производстве лизина на Чаренцаванском ОПЗ Лизин.

Использование штамм а-продуцента B.lactofermentum H1/1TI/1A-88R иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Ферментацию штаммов B.lactofermentum НИТИА-88К и B.lactofermentum НИТИА-88 (в качестве контроля) проводили в отдельности в присутствии фагов BIA 1, BIA 2 и BIA 3 и комбинации фагов в 750 мл колбах Эрленмейера в 20 мл среды состава: меласса 12,5% (по содержанию редуцирующих веществ -- ПВ), сернокислый гидролизат паприна 1,5% (по сухому весу паприна), 0,9%,

(NH4).S04 1 %, (МНфНРОд 0,1 %, мел 2%, рН среды 7,2-7,4, В качестве посевного материала использовали культуру штаммов, выращенных в течение 20 ч на следующей среде: меласса 3% (по содержанию РВ), гидролизат паприна 0,3% (по сухому весу паприна), мел 2%. Посевной материал вносили в количестве 10%. Одновременно вносили лизат отдельных фагов или их комбинаций (начальные титры фаговых частиц указаны в

таблице). Ферментацию проводили при температуре 30°,в течение 66 ч. В конце ферментации определяли оптическую плотность культуральной жидкости (ОП), выход лизина и титр фагов. Из таблицы видно, что

при одновременном культивировании

штамма B.lactofermentum НИТИА-88Н с фагами титр последних заметно снижается, что свидетельствует о неадсорбционной природе мутаций, обеспечивающих фагорезистентность продуцента. Новый штамм по своей лизир ующей активности не уступает родительскому штамму B.lactofermentum НИТИА-88 (см.табл.).

П р и м е р 2. Посевной материал штамма

B.lactofermentum HHTHA-88R выращивали в 750 мл колбах Эрленмейера в течение 24 ч в 100 мл среды следующего состава: меласса 2% (по содержанию РВ), гмдролизат паприна 1,3% (по сухому весу паприна),

NH/5CI. 0,3% (по содержанию аммонийного азота), мел 2%. 500 мл посевного материала вносят в два ферментера объемом 10 л, содержащие по 4,5 л питательной среды состава: меласса 12% (по содержанию РВ),

гидролизат паприна 2% (по сухому весу паприна). NHnC 0,5% (из расчета содержания аммонийного азота). (NH HPO/j 0,1%, тиа- минахлорид 0,01 мг%, дестиобиотин 0.01 мг%, Ферментацию проводят при 301°, рН среды 7,4-7,6 в периодическом реиме с подпиткой.

По мере вспенивания ферментационой среды добавляют пеногаситель - про- инол Б 400. Подпитку проводят питательной средой состава: меласса 30% по содержанию РВ), гидролизат паприна 1,0% (по сухому весу паприна), 1,2% из расчета содержания аммонийного азоа), (МН4)2НР04 - 0,1 %, тиаминахлорид 0,01 мг%, дестиобиотин 0,01 мг%. Питательную среду подают по достижении содержания редуцирующих веществ в ферментационной среде до 0,6 - 1,5% со скоростью, обеспечивающей уровень РВ 1,2-1,3%. Через 20 ч ферментации в один из ферментеров вносят лизат фагов BIA 1, 2, 3 в титре 1 1-105 каждого. Объем ферментационной среды в ферментерах к концу ферментации (через 70 ч) составляет 7 л. При этом в куль- туральной жидкости при ферментации B.lactofermentum HHTHA-88R накапливается 72 г/л лизина, а в культурэльной. жидкости штамма B.lactofermentum НИТИА-88 - 17 г/л,

ПримерЗ. Посевной материал штамма B.lactofermentum НИТИА-88Н готовят, как описано в примере 2. В ферментер вместимостью 5 м3 вносят посевной материал в о ьеме 450 мл. При этом используется пи- Т.ЧТРЛЬНЗЯ среда в объеме 2,5 ± 0,2 м следующего состава: меласса 3% (по содержанию РВ), гидролизат паприна 2,2 % го сухому весу паприна), длительность ации 24 ч при температуре 30° ±2. Рас ;л подаваемого стерильного воздуха 2Г - JOO м . Полученный посевной материал, С ,Г.ГЧРЖЯ| f . R КО - .,dUHH

5, С.5 . в объеме 2,5± и... г- ;,сят в ферментер вместимостью 50 м , содержащий 24 м питательной среды: следующего состава: меласса 10,2% (по содержанию РВ), гидролизат паприна - 1,8% (по сухому весу лаприна), 0,6% (из расчета со- держания аммонийного азота), (NH/02HP04 0,05%, пропинол Б 400 10.л. Ферментацию проводят в периодическом режиме при

30°±2, рН среды 7,3 ±0,3 и расходе воздуха на аэрацию 1700-2400 мЗ/ч. Пеногаситель пропинол Б 400 в виде 15% эмульсии задают в ферментер по мере вспенивания куль- туральной жидкости. В процессе ферментации по мере снижения содержания РВ ниже 2.5% в ферментер дробно подают по 1,0 м подпиточной питательной среды состава: меласса - 20% (по содержанию РВ), NhMCI 1,3% (по содержанию аммонийного азота), объем ферментационной среды в реакторе к концу ферментации составляет 30 м ± 2. За это время в культу- ральнойжидкости штамма

B.lactofermentum НИТИА-88Р накапливается 58 г/л лизина при коэффициенте конверсии 46,0%. Новый фагоустойчивый штамм-продуцент лизина B.lactofermentum. НИTI/1A-88R

был использован в реальных производственных условиях ЧОПЗ Лизин. В процессе 20 ферментации не было отмечено ни одного случая фаголизиса; выход лизина в производственных условиях колебался от 35 до

58 г/л (без учета ферментации с технологическими нарушениями). В противоположность этому при ферментациях с применением фагочувствительного штамма B.lactofermentum Н. неоднократно

отмечены случая фаголизиса. При этих ферментациях выход лизина не превышал 20 г/л.

Таким образом, новый штамм-проду- цент B.lactofermentum HHTHA-88R является более технологичным благодаря признаку устойчивости к выделенным в производственных условиях фагам. Эта харзк- тер 1стика нового фагочувствительного штамма B.lactofermentum НИТИА-SSR диктует необходимость его внедрения в производстве лизина.

Формула изобретения Штамм бактерий Brevibacterium lacto.fermentum ВКПМ В-5453 - продуцент лизина.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм бактерий Brevibacterium lactofermantum HHTHA-88R получен генетико-селекционным путем из штамма Brevibacterium lactofermentum НИ- ТИА-88. Штамм устойчив к бактериофагам, лизирующим Культуры Brevibacterium lactofermentum. При выращивании на традиционных средах при 30° - 32° и рН среды 7,0-7,4 в течение 66 часов проявляет активность до 62 г/л лизина, что соответствует конверсии по использованному сахару 48%. 1 табл.

Выход лизина, рост культуры и титр фага при ферментации штаммов B.lactofermentum НИТИА-88 и B.lactofermentum НИТИА-88Я в присутствии отдельных фагов BIA 1. BfA 2 и BIA 3

и их комбинаций.

Продолжение таблицы