Штамм гриба ASpeRDILLUS oRYZaL-продуцент амилолитических и протеолитических ферментов Советский патент 1988 года по МПК C12N9/62 C12N1/14 

4 4 О О tsD КЭ

Изобретение относится к ферментной отрасли промьшшенности и касается нового штамма, внеклеточные ферменты которого используются для дес- трукции природных биополимеров при получении Сахаров, аминокислот, ферментов.

Цель изобретения - получение штамма, обладающего более высокой ак- тивностью и обеспечивающего повьппе- ние выхода целевого продукта с заданным составом.

Штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-369 получен из музейного штамма Aspergillus oryzae 251-90 ЛС S 123 ВНИИ пищевой биотехнологии путем трек этапов селекции с применением тепловой обработки, обработки ультрафиолетовым излучением, а также нитрозоэтилмочевиной (НЭМ).

Амилолитическая активность -определялась по гидролизу крахмала, протеолитическая активность - по гидролизу гемоглобина модифициро- ванным методом Ансона.

Активность ферментов в культу- ральной жидкости на пятые сутки роста составляет по амилазе 33,5 ед/мп, а по протеазе 33,8 мг тирозина/мл, что в три раза превосходит известный.

Морфологические признаки. Мицелий септирован, колонии концентрические, конидиеносщл хорошо диффе- ренцированы, формируются к 35-36 ч роста. На концах гиф под микроскопом хорошо виден эксудат в виде мелких капель прозрачной жидкости. Конидии круглые 4,5-6,3 мкм, в массе зеленые. Культуральные признаки. Рост на сусло-агаре при на седьмые сутки роста: диаметр колосшй 45-50 мм, рост концентрический, - складчатость радиально-концентричес- кая. Поверхность пушистая. Спороно- шение по всей поверхности за исключением jMKoro края. Мицелий белый, споры в массе зеленые. Пигментация среды не выражена.

Рост на среде Чапека-Докса при на седьмые сутки: диаметр колоний 30-35 мм, рост концентрический Складчатость хорошо выражена, ради- ально-концентрическая. Поверхность пушистая. Спороношение дифференцировано, интенсивное в центре колони и слабо вьфажено к периферии. Мицелий белый, споры в массе желто-зеленые. Пигментация среды не рыражена. Центр колонии приподнят, края колонии находятся ниже уровня среды. Среду под собой гидролизует с образованием полости (среда отстает от стеклянной поверхности чашки).

Рост на среде Ваксмана с пептоном и глюкозой при 30°С на седьмые сутки: диаметр колонии 35-45 мм, IpocT концентрический, складчатость радиальная. Поверхность бархатистая Спороношение дифференцировано: интенсивное в центре и слабо вьфажено к перифевиио Мицелий белый, споры в массе светло-зеленые. Пигментация в точке интенсивного спорообразования слегка красноватая. Края колонии находятся на уровне с поверхностью, среды.

Физиолого-биохимические признаки Ассимилирует глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, ксилозу, сахарозу, глицерин. Гидролизует крахмал, а также белки. Используют аммонийную нитратную и белковую формы азота.

Штамм интенсивно продуцирует oL -амилазу и комплекс протеаз на среде с ячменным суслом, соевой мукой и .КН,РОц при 28-30 с на пятые сутки роста. Активность ферментов в культуральной жидкости, при этом составляет по об -амилазе 33,5 ед/мл по протеазе 33,8 мг тирозина/мл.

Для выращивания мицелиального посевного материала берут среду следующего состава, вес.%. ячменная мука 8°-10, соевая мука 0,5-1,0, 0,5-1,0, вода водопроводная остальное, В среду вносят продуцент в виде суспензии спор (конидий), полученной известным способом, и инкубируют при 28-30 с в течение 43-44 ч После чего готовый посевной материал переносят на среду следующего состава, вес.%: ячменная мука 14-20, соевая мука 0,5-3,0, 0,5-1,0, вода водопроводная остальное, и. инкубируют при 28-30 с в течение 4 - 5 сут.

В конце инкубации измеряют ферментативные активности, (амилоли- тическую и протолитическую) в культуральной жидкости.

Сравнительные результаты по известному и предлагаемому изобретениям сведены в таблицу.

Из, таблицы видно, что использование продуцента А.oryzae 824-32 позячменная мука 20, сое- КНчРО 1, вода водопро- .f и инкубируют в те

воляет увеличить выход целевого продукта в три раза, если у известного активности составляли по АС-11,О и по 11С-8 6 ед/мл, то в предлагаемом способе АС-33,5 и ПС-33,8 ед/мл. Кроме того, изменение концентрации ячменной муки приводит к преимущественному синтезу либо амкполитических либо протеологических ферментов, что используется при направленном получении конкретного ферментного препарата.

Пример 1. При подготовке обеих сред сжижение пр оводят добавлением 0,5 ед. ot-амилазы на 1 г крахмала, среды.

Выращивание гриба A.oryzae 824- 32 в виде мицелиаль ного посевного материала проводят на среде, вес,%: ячменная мука 8, соевая мука 0,5, 0,5, вода водопроводная остальное, и инкубирзтот -при 28° С в течение 43 ч.

Готовый мицелиапьный посевной препарат вносят в среду следующего состава, вес.%: ячменная мука 14, соевая мука 0,5, 0,5, вода водопроводная остальное, и инкубируют при в течение 4 сут.

В конце выращивания ферментативные активности составляют по АС-20,7 по ПС-17,3 ед/мп„

И р и м е р 2. При подготовке обеих сред ожижение проводят добавлением 1,0 ед. оС-амилазы на 1 г крахмала среды.

Вьфащивание гриба A.oryzae 824-32 в виде мицелиального посевного материала проводят в среде, вес.%: ячменная мука 10, соевая мука 1, КН.РО 1, вода водопроводная - остальное, и инкубируют при 30 С в течение 44 ч

Готовый мицелиапьный посевной материал вносят в среду следующего сое тава, вес.Г вая мука 3, водная остальное, чение 5 сут при ,

В конце выращивания Лерментатив- ные активности составляют по АС-19,9 по ПС-22,3 ед/мло

Пример 3. При подготовке обеих сред ожижением проводят добавлением 0,5 ед о Л-амилазы на 1 г крахмала среды

Выращивание гриба A.oryzae 824-32 в виде мицелиального посевного материала проводят в среде, вес.%: яч

0922.

менная мука 9, соевая мука 1,5, KHjP04 0,5, вода водопроводная остальное, и инкубируют в течение 44 ч при .

Готовый мицелиальный посевной материал вносят в среду следующего состава, вес.%: ячменная мука 18, соевая мука 1,5, 0,5, вода водо0

5

0

g

0

5

0

проводная

lO

остальное, и инкубируют

при 30 С в течение 5 сут.

В конце выращивания.ферментативные активности составляют по АС гЗЗ,5, по ПС-33,8 ед/мл.

Пример 4. Вьфащивание осуществляется аналогично примеру 1, отличие состоит в том, что при подготовке обеих сред ожиг Кение проводят добавлением 0,4 ед oi-.амилазы на 1 г крахмала среды.

Выращивание гриба Aooryzae 824-32 в виде мицелиального посевного мате-. риала проводят на среде, вес„%: ячменная мука 7,5, соевая мука 0,3, 5 0,8, вода водопроводная остальное, и инкубируют при 27 с в течение 41 часа.

Готовый мицелиальный посевной материал вносят в среду следующего состава, вес.%: ячменная мука 12, соевая мука 0,4, 0,4, вода водопроводная остальное, и инкубируют при в течение 4 сут.

В конце вь1ращивания ферментативные активности составляют по АС-20,0 ч по ПС-19,3 ед/мп.

Пример 5о Выращивание осу- щес.твляется аналогично примеру 2, отличие состоит в том, что при подготовке обеих сред проводят ожижение добавлением 1,1 ед. об -амилазы на 1 г крахмала среды.

Выращивание гриба A.oryzae 824-32 в виде мицелиального посевного материала проводят на среде, вес.%: ячменная мука 12, соевая мука 1,6, 1,1, вода водопроводная остальное, и инкубируют в течение 45 ч

. о при

31 С.

Готовый мицелиальный посевной материал вносят в среду следующего состава, весо%: ячменная мука 21, соевая мука 3,1, 1,6, вода водопроводная остальное, в течение 5,3 сут при .

В конце вьфащивания ферментативные активности составляют по АС-8,2, по ПС-41,7 ед/мл.

и инкубируют

, л.

514409226

Использование предлагаемого изоб-Формула изобретения ретения по сравнению с известным П9вьшает выход целевого продукта, сШтамм гриба Aspergillus oiryzae

заданным соотношением ферментов, приg ВКПМ F-369 - продуцент амилолитичесу

этом способ прост в осуществлении.кюс и протеолитических ферментов.

Изобретение относится к получению ферментных препаратов и может быть применено в микробиологической промьшшенности при получении ио- логически активных соединений, в сельском- Хозяйстве, кожевенной про- мьниленности. Целью предлагаемого изобретения является получение штамма, обладающего более высокой ак- тивностью и обеспечивающего повышение выхода целевого продукта с заданным составом. Штамм получен из музейного путем трех этапов селекции с применением тепловой обработки, обработки ультрафиолетовым излучением, а также нитрозоэтилмочеви- ной. Применение в качестве продуцента Aspergillus oryzae ВКПМ F-369