Вектор рМВ 123 для получения фрагментов ДНК с произвольными липкими концами и способ его конструирования Советский патент 1988 года по МПК C12N15/00 

4

О)

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии и представляет собой векторную ДНК рМВ 123 для получения фрагментов ДНК с произвольными липкими концами. Полученная рекомбинантная плазмидная ДНК имеет молекулярную массу 1,8 МД и содержит EcoR I - Pst I фрагмент ДНК плазмиды PVR 222 с геном В-лак- тамазы и частью модифицированного гена й-галактозидазы E.coli, а также синтетический полилинкер длиной 38 п.о. Полипинкер включает между попарными сайтами Fok I и Hga 1 набор сайтов для эндонуклеаз рестрикции SalG I, Асе I, Hind II, Hind III и Bam HI противоположной полярности. Целевые фрагменты ДНК получают путем клонирования субфрагментов в составе сконструированной векторной плазмиды . рМВ 123 по сайтам, содержащимся между попарными сайтами Fok I и Hga I с последующим их выщеплением с помощью рестриктаз Fok I или Hga I. 2 с.п. ф-лы. (Л

СП

со

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно к получению векторных реком- бинантных ДНК методами генетической инженерии и может найти применение в биотехнологии при создании штаммов- продуцентов целевых продуктов.

GGATGACGCGTCGACAAGCTTGGATCCGCGTCATCCAG

1 ACGTCCTACTGCGCAGCTGTTCCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTAA7

с находящимися между попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции Fokl и Hgal местами для эндонуклеаз рестрик Щ1И SalGl, AccI, HindII, Hindlll и BdmHI.

Конструирование вектора рМВ 123 проводят следующим образом.

Расщепляют ДНК плазмиды pNIMB эн- донуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI и лигируют полученный гидроли- зат с синтетическими,олигонуклеоти- дами GATCCGCGTCATCCAG и AATTCTGGAT- GACGCG с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки E.coli ВМН 7118 или IM 103 и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину,с фенотипом Lac (промежуточная плазмида рМВ 121), Из индивидуальных клонов вьщеляют ДН плазмиды рМВ 121, которую расщепляют эндонуклеазами рестрикции PstI и SalGI и лигируют с рлинонуклеотидами

GGATGACGCG и TCGACGCGTCATCCTGCA.nony

ченной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фенотипом Lac (плазмида рМВ 123),

Конструкция рМВ 123 облегчает поиск колоний с рекомбинантными плаз- мидами. Поскольку полипинкер для клонирования субфрагментов расположен в кодируницей последовательности ef - пептида Й-галактозидазы,вставка суб-ч фрагмента может нарущить -его рамку считывания и привести к изменению фенотипа, полезному для селекции рекомбинантов.

В качестве клетки-хозяина при работе с вектором рМВ 123 удобно ис- попьзовать E.coli с делецией в начал гена й-галактозидазы, например, E.coli Lac Zm 15. Плазмида рМВ 123 благодаря й/-комплементации с -хромосомным геном LacZ сообщает таким бактериальным клеткам фенотип Lac, который при вставке субфрагмента об

6

1592

Цель изобретения - создание вектора, позволяющего получать клонируемые в нем фрагменты ДНК с произ- П зльными липки концами,

Сконструирован вектор рМВ 123, состоящий из EcoRl-PstI фрагмента ДНК вектора PVR 222 и полилинкера:

щей длиной Зп±1 п.о., либо если, внутри его находится ATG-кодон, содержа- щий Зп или Зп+1 п.о. от этого ATG- кодона до 3 -конца субфрагмента, изменяется на Lac7, что позволяет легко отбирать колонии с рекомбинантными плазмидами (не окрашенные на индикаторной среде с X-Gal).

Пример 1. Химический синтез олиг онуклеотидов

GGATGAGGCG;

TG GACGCGTCАТС CTGCА;

GATCCGGGT CATCCAG;

GAATTCTGGATGACGCCG

;проводят твердофазным фосфотриэфирным методом. В качестве носителя используют модифицированный силохром. Наращивание олигонуклеотидной цепи проводят от 3 - к 5 -концу с помощью динуклеозиддифосфатных производных (MeO sTrNp (PhCl)Np(PhC) . Выделение целевого продукта после деблокирования реакционной смеси проводят путем последовательных хроматографии на Lichrosorb PR 18 сначала в 0,1 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрилаI 15-40%. Затем раствор вьщеленного тритилолигонуклеотида упаривают досуха, растворяют в 2,5мл 80%-ной водной уксусной кислоте и .выдерживают при комнатной температуре 45 мин.. .Раствор упаривают досуха, растворяют остаток в 1 мл дистиллиро ванной воды и хроматографируют -на Lichrosorb PR 18 в 0,05 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила 5-20%.

Конструирование целевой векторной ДНК рМВ 123 состоит из двух этапов. На первом этапе конструируют, промежуточную плазмидную ДНК рМВ 121.

5 ДНК плазмиды pNIMB гидроли- зуют совместно эндонуклеазамн рестрикции BamHI и EcoRl в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 (20 мМ трис-НС1, рН 7,8,10 мМ MgClj, 10 мМ 2-маркапто- этанол) и 100 мМ NaCl при 37°С 1 ч. Реакционную смесь после добавления 5 мкл 0,4 М ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и цзо- амилового спирта. Затем к реакционной смеси добавляют NaAc до концентрации 0,3 М, рН 7,0 и осаждают ДНК двумя объемами этанола. Полученный препарат вектора pNIMB растворяют в 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС1, рН 7,8; 1 мМ ЭДТА).

К 5 мкл раствора вектора pNIMB добавляют по 20 пмоль олигонуклеоти- дов (III и IV), 2 ед. ДНК-лигазы фа- га ТА в 30 мкл буфера 2 (20 мМ трис- НС1,- рН 7,5, 10 мМ MgCl, 10 мМ 2- маркаптоэтанол и 0,5 tM ATP).

Реакционную смесь вьщерживают 12 ч при 10°С,- затем используют для трансформации клеток E.coli ВМН 7118 Суспензию клеток после трансформации высевают на 1,5% LB агар, содержаршй 75 мкг/мп ампициплина и 50 мкг/мп I X-Gal.Чашки инкубируют 12 ч при 37°С, Из колоний, имекяцих Lac фенотип, щелочным методом вьщеляют ДНК плазмиды рМВ 12t. Bspl и Fokl : гидролизаты полученной ДНК анализируют в 4% ПААГ. Клон, имеющий дополнительный Fok I- сайт в плазмидной ДНК, выращивают . в 100 мл среды, содержащий 50 мкг/мп апициллина, в течение 16 ч при 37 С на -качалке (200 об/мин). Кретки собирают центрифугированием (6000 об/мин 10 мин, 4°С), плазмидную ДНК рМВ 121 вьзделяют щелочным методом с после5CCCAGATCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAAGAAGTG; (V) 5GAAAATTTTTGATTTGTGCTAAATTCAGCACrrCTTCCAG (VI) 5ACrrACGTCCCCGTGACTTAATCTCCAATATCAACGTTAAT; (VII)

5CCTGTCGACCCTTCAGTTCCAGTACAATTACGTTGATA

Из полинуклеотидов V-VIII получают дуплексы для клонирования.

Реакционную смесь, содержащую по 100 пкмоль меченного -у-Р АТР поли- с нуклеотида (V) и фосфорилированного холодным АТР полинуклеотида (VI) в 100 мкл буфера 3 (60 i трис-НС1, 1рН 7,5j 10 Ш MgCli, Ш ЛI 2-меркаптолдующей дополнительной очисткой в градиенте гшотности CsCl.

5 мкг ДНК плазмиды рМВ 121 расщепляют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции PstI в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 и 50 мМ NaCl, 1 ч при 37 С. Затем к реакционной смеси добавляют NaCl до концентрации 150 tM, 2-меркаптоэтанол до 20 мМ и 10 ед. эндонуклеазы рестрикции SalGI, выдерживают 1 ч при . Реакционную смесь после добавления 6 мкл 0,4 М ЭДТА} рН 8,0 экстрагируют равным объ- емом,,водного фенола и изоамилового спирта. ДНК вектора рМВ 121 осаяда- ют этанолом и растворяют в 50 мп ТЕ- буфера.

5 мкл раствора ДНК плазмиды рМВ 121 отбирают для получения вектора рМВ 123. К реакционной смеси добавляют по 20 пкмоль олигонуклеотидов I и II, 2 ед. ДНК-лигазы:фага Т4 в 30 мкл буфера 2 и вьщерживают 12 ч при 10°С. Полученной лигазяой смесью трансформируют клетки E.coii ВМН 7118. Из колоний (получение см.выше) имеющих Lac фенотип, вх челяют плазмидную ДНК. После рестрикдаонного анализа с помощью Bspl и Fokl эндо- нуклеаз определяют ее первичную структуру в районе встроенного полилинкера по методу Максама-Гилберта.

Пример 2. Получение субфраг мента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствукицую 60-98 аминокислотам человеческого интерлейкина-2, -с заранее запланированными липкипи концами.

Описанным способом синтезируют и вьделяют следукяцие полинукпеотиды:

(VIII)

этанол), нагревают 10 мин при 50°С, охлаждают до 20°С, добавляют dNTP до концентрации 250 мкм и 10 ед. ДНК-по- лимеразы 1 (фрагмент Кленова). Реак- 1ЩОННУЮ смесь инкубируют 30 мин при ,, добавляют 10 мкл 0,4 М ЭДТА-, рИ 8,0 и экстрагируют водным фенолом. ДНК-дуплекс осаждают ацетоном, содер51

жащим 2% LiClO, промывают спиртома высушениьп1 осадок растворяют в воде, Полученный дуплекс pacntennHror обработкой 200 ед эндонуклеазы Bgl II в 200 мкл буфера 2, содержащего 50 мМ NaCl, в течение 12 ч при 31°С Аналогично получают дуплекс из по- линуклеотидов (VII и VIII), которьй затем расщепляют обработкой 500 ед. эндонуклеазы SalGI в 200 мкл буфера 2, содержащего 150 мМ NaCl, в течение 12 ч при 37°С. Оба рестрикта выделяют с помощью гель-электрофореза в 8% ПААГ.

Реакционную смесь,, содержащую по 2 пмоль приготовле; ных дуплексов и 0,25 пмоль векторной ДНК, полученной из рМВ 123 совместным расщеплением эндонуклеазами рестрикдаи BamHI и SalGI (условия см, выше), обрабатывают 2 ед, ЦНК-лигазы в описанных условиях. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli ВМН 7118 или IM 103 ДНК, вьщеленные

из колонийJ имеющих Las- фенотип5 гибридизуют с Р-мечеными зондами, полученными из полинуклеотидов (V и VIII). ДНК, гибридизуюпщеся с обоими зондами, дополнительно анализи- руют с помощью Bspl и EcoRI+PstI гидролиза..

Колонии, имеющие плазмиды pIL 912 со вставкой требуемого размераj вьфа щивают в 100 мл LB среды. Для полу- чения целевого субфрагмента, коди-- рующего часть гена человеческого IL-2 с заранее запланированными липкими концами, 15 мкг ДНК плазмиды pIL 912 в 150 мкп буфера 1, содержа- щего 50 NaCl, обрабатывают 20 ед. эндонуклеазы регистрикции Fokl или Hgal при 37°С, Целевой фрагмент длиной 114 нуклеотидных пар вьщеляют с, помощью электрофореза в 6% ПААГ,-

Структура полученного фрагмента подтверждена методом Максама-Гилберта.

Пример 3. Контроль на конью гативность плазмиды рМВ 123.

Плазмидную ДНК рМВ-123 трасформи- руют по описанной методике в штамм E.coli ВМН 7118. Колонии, выросшие при 37 С за 16 ч на LB агаре с ампициллином (АР 50 кг/мл), пересевают в LB-среду с тем же антибио тиком.и растят до плотности Ночную культуру штамма IM 103 засе.вают и растят .в тех же условиях до плотности 596

, Культуры смешивают в равных объемах по 0,5 МП, инкубируют 1 ч при 37 с, покачивая. После чего 100 мкп высевают на LB агар, содержащей антибиотики Ар (50 мкг/ мп) и Str (100 мкг/мл), и оставляют на ночь при 37°С. Стерильность, на чашках сохраняется. Эффективность коньюгации меньше .

Таким образом, применение векторной пЯазмнды рМВ 123 для получения субфрагментов с заранее запланированными липкими концами имеет существенные преимущества по сравнению с прототипом. Прежде всего конструкция векторной ДНК рМБ 123, содержащая между попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции -Fokl и Hgal противоположной ориентации, набор сайтов для рестрик таз SalGI, AccI, Hinglll, I5amHI дает возможность клонировать фрагмент из нескольких частей и таким образом получать протяженные химически синтезированные последовательности ДНК, В примере 2 субфрагмент гена человеческого интерлейкина-2 получен из двух-дуплексов за одно клонирование. Получение этого же субфрагмента в плазмидах типа pBBv потребует трех клонирований. В этом случае необходимо проклонировать отдельно каждый из тупоконечных дуплексов, а затем после получения липких концов осуществить сборку в субфрагмент в другом векторе. Применение рМВ 123 для получения целевых последовательносте ДНК позволяет уменьшить объем биохимической и генно-инженерной работы в несколько раз. Несомненным преимуществом является использование при получении пвоизвольньк липких концов субфрагментов коммерчески доступных эндонуклеаз рестрикции Fokl и Hgal.

Векторная плазмида рМВ 123, позволяющая получать субфрагменты с заранее запланированными липкими концами находит применение при получении .генов и их фрагментов, ценных белков, конструировании регуляторных элементов транскрипции и трансляции.

Формула изобретения

плазмиды pVR 222 с репликоном плазми- ды pVR 222 геном В-лактамазы и частью модифицированного гена В-галактозида-

GGATGACGCGTCGACAAGGCTTGGATCCGCGTCATCCAG

ACGTCCTACTGCGCAGCTGTTCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTAA

между попарными сайтами эндонукпеаз рестрикции Fokl и Hgal которого расположены сайты для эндонукпеаз рестрикции SalGI, AccI, Hingll, Hinglll и BanHI противоположной полярности

фрагменты размером fl, 80, 100, .174, 257 (область полилинкера), 267, 290, 434, 457, 587 п.о., образукищеся после расщеп;1ения эндонукпеазы Bspl;

фрагменты размером 26, 34, 67, 110, 147, 200, 242, 404, 420 (область полилинкера) 489, 500 п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазы ДНК,

фрагменты размером 8, 84, 181, 244, 287, 614, 1254 п.о., образующеся после,расщепления эндонуклеазы Fokl;

вставку субфрагмента для клонирования по Sal, GI и BamHI-сайтам полилинкерной области;

ген В-лактомазы, определяющий устойчивость к ампициплину; .

емкость не менее 622 n.o.j

- ью -

1446159«

зы Echerichia coli, синтетический полилинкер размером 38 п.о., имеющий структуру

штаммы-хозяева: штаммы E.coli с LacZ /1М15 фенотипом.

ДНК-лигазы фага Т4, лйгазной смесью трансформируют клетки E.coli, из трансформанты, именлцих фенотип Lac, вьзделяют ДНК, расщепляют эндонуклеа- зами рестрикции PstI и SalGI, выделяют векторную ДНК, которую лигируют с синтетическими олигонукпеотидами GGATGACGCGTGGACGCGTCATCCTGCA с помощью ДНК-лигазы фага Т4, вновь трансформируют клетки E.coli, среди транс формантов, устойчивых к ампициллину и имеющих фенотип Lac, отбирают клоны, имеющие целевую первичную структуру ДНК в райЪне полилинкера плазмиды.