Вектор pFH 124 для получения фрагментов ДНК с произвольными "липкими" концами и способ его конструирования Советский патент 1991 года по МПК C12N15/00 

GGATGCGCGTCGACAAGCTAGCTTGGAT.CCGCGTCATCCAG ACJGTCCTACGCGCAGCTGTTCGATCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTAA,

Изобретение относится к молеку- лярной биологии и генетической инхе Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных ДНК методами генетической инженерии и может найти применение в биотехнологии при создании штаммов-продуцентов целевых продуктов. Целью изобретения является повышение стабильности рекомбинантов. Цель достигается конструированием векторной плазмиды pFH S24, состоящей из следующих элементов: нерии. Целью изобретения является по- вышенир стабильности. Сконструирована векторная ДНК pFH 124, имеющая молекулярную массу 1,8 Md, содержащая Pvu II - большой фрагмент ДНК плаэми- ды pUC 18 с репликоном этой плазмиды и геном |3 -лактомазы, а также Pvu II - малый фрагмент ДНК плазмиды рМВ 124, (включающий часть модифицированного |гена й-галактозидады с синтетическим полилинкером. Полилинкерная область длиной 42 п..о. ограничена Е. coRI и Pst I сайтами, а между попарными сайтами Fok I и Hga I противоположной полярности содержится набор сайтов эндонуклеаз рестрикции Sal GI, Асе I, Hind II, Bam HI. 2 с.п. ф-лы. Pvu II - фрагмента ДНК плазмиды pUC 18 (2364 п.о.), содержащего реп- ликон плазмиды pUC 18 и ген р-лакта- мазы, определяющий устойчивость к ампициллину; Pvu II - фрагмента ДНК плазмиды рМВ 124 (320 п.о.), включающего в свой состав часть модифицированного гена р-галактозидазы и синтетический полилинкер, имеющий структуру i fe с; о к а

содержащий между попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции Fok I и Hga I противоположной полярности сайты для эндонуклеаз рестрикции Sal GI, Асе I, Hinc II и Bam HI. Вставка субфрагмента для клонирования осуществляется по Sal GI и Bam HI-сайтам полилинкер- ной области. Емкость вектора не менее 200 п.о.

Штаммы-хозяева: штаммы Е. coli с ас Z&M 15 фенотипом„ Молекулярная . масса плазмиды pFH 124 равна 1,8 Md (2684 п.о.) .

Для достижения цели используют способ конструирования вектора pFH 124, заключающийся в том, что ДНК pUC 18 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Pvu II, выделяют фрагмент дли- ион 2364 п.о., циклизуют его с помощью Т4 ДНК-лигазы, полученной лигазной смесью, трансформируют клетки Е. coli Ш 103, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину с Lac-феноти- пом. ДНК, полученную из этих клонов, расщепляют эндонуклеазой рестрикции Pvu II и лигируют с Pvu-фрагментом ДНК рМВ 1 24 (320 п. о.) , попученной ли- газной смесью, трансформируют клетки Е, coli IM 103, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину с Lac-фенотипом.

Пример 1. 50 мкг ДНК плазмиды рМВ 124 гидролизуют эндонуклеа- зой рестрикции Pvu II в 100 мкл раствора, содержащего буфер 1 (50 мМ трис IHC1, рН 7,5, 10 мМ MgCl,, 10 мМ 2-мер каптоэтанол) и 50 мМ NaCl 1 ч при 37°С. Реакционную смесь прогревают 2 мин при 65 С, добавляют 10 мкл 0,1% бромфенолового синего в 50%-ном водном глицерине и подвергают электрофорезу в 4% ПААГ. Фрагмент ДНК длиной 320 и.о.элюируют из геля на ионооб- менную бумагу ДЕ-81. С бумаги фрагмен смьшают 1,5М LIC104 (рН 8,2x25 мкл) при 50 С и осаждают 10 объемами ацетона. Осадок промывают этанолом, высушивают на воздухе и растворяют в 30 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НС , 1 мМ ЭДТА, рП 8,0).

1 мкг ДНК pUC 18 гидролизуют зндо- нуклеазой рестрикции Pvu II в условиях, описанных выше. 10 мкл реакцибн- ной смеси после отжига (5 мин, 65°С) инкубируют с 5 ед. ДИК-лигазы-фага Т4 в 20 мкл буфера 1, содержащего 0,25 мМ АТФ в течение 12 ч при }0°С. Десятую часть реакционной смеси ис- пользуют для трансформации клеток Е. coli Ш 103, обработанных СаС1&. Плазмида pUC 18 сообщает клеткам Д. coli IM 103 фенотип Lac . Трансформанты отбирают на 1,5% YT-arape,

содержащем 50 мкг/мл ампициллина, Y-gal, IPTG. Колонии, имеющие . Lac-фенотип, содержащие pUC 18 без природного Pvu II фрагмента, культи

, 0

5 Q

5

вируют в 5 мл среды 12 ч при 37°С, 1 мкг плазмидной ДНК, выделенной из этой биомассы, .расщепляют эндоиукле- азой рестрикции Pvu II в объеме 30 мкл. Реакционную смесь разбавляют 10 объемами 2%-ной LiClO в ацетоне, осадок промывают этанолом, сушат на воздухе. Затем растворяют его в 30 мкл буфера 1, дополнительно содержащего 0,5 мМ АТФ и инкубируют с 1 мкг Pvu II-фраг- мента ДНК (320 п.о.) рМВ 124 в присутствии 5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 12 ч при 10°С, Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е. coli IM 103, как описано выше. Из колоний, имеющих Lac -фенотип, щелочным методом ны деляют ДНК, которую анапнэируют путем Pvu II, Bsp I, Bam HI. Sal GI-гидро- лиза.

Пример 2. Определение стабильности рекомбинантов вектора pFH 124 с максимальной и минимальной длиной встроенного фрагмента.

а) для определения рекомбинантов вектора pFH 124 с максимальной длиной встроенного фрагмента в этом в екторе , клонируют по Pst I и Sal 1-сайтам фрагмент ДНК полноразмерной копии гена интерлейкина - 2 человека, длиной 413 п.о.

Для этого 0,25 пкмоль векторной ДНК, полученной из pFH 124, совместным расщеплением эндонуклеазами рестрикции Pst I (7 ед. 50 мМ NaCl, 1 ч, 37°С) ио8а GI (10 ед. 150,MMNaQl 5 ч, 37 С) и 3 пкмоль указанного фраг-. мента ДНК обрабатывают 20 ед. Tj ДНК- лигазы в условиях, описанных выше Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е. coli Ш 103. Колонию с Lac фенотипом проводят через 4. пассажа, как описано в примере 2. После каждого пассажа выделенную из биомассы рекомбинантную плазмидную ДНК pIL 2 анализируют Pvu II, Bsp I Eco RI I - Pst I эндонуклеазами рестрикции, Результаты гидролиза соотт ветствуют ожидаемым и равны 200, 520, 2260 п.о. для Pvu IT - рестриктазы; П, 80, 202, 174, 267, 287, 290, 380, 434, 457, 587 и.о. для Bsp I - рестриктазы и 440 п.о. для Eco RI - Pst I пары рестриктаз. Фенотип трансформированных клеток не зависит от числа проведенных пассажей. Количеств, во колоний с указанными фенотипом / составляет 970+25 на 1000. шт при 95% уровня доверия;

б) для определения рекомбинантов вектора pFH 124 с минимальной длиной встроенного фрагмента в этом векторе клонируют два олигонуклеотида OGCGTCATCCAG (12 п.о.) и AATTCTTGGATCACGCG (16 п.о.), которые образуют между собой комплементарный дуплекс длиной 12 п.о.

Для этого 5 пкмоль ДНК pFH 124 гидролиэуют 20 ед. рестриктазы Sal GI в 50 мкл буфера 1 и 150 мМ NaCl в условиях, описанных выше. Реакционную смесь осаждают 2%-ным LiClO в ацетоне. Промытый и высушенный осадок ра- створяют в этом же объеме буфера . К раствору добавляют dNTP -до концентрации 100 мкМ, 6 ед. ДКК-полимеразы 1 (фрагмент Кпенова) и реакционную смесь выдерживают 10 мин при комнат- ной температуре. Затем смесь прогревают 2 мин при 65 С, добавляют 5 м NaCl, 20 ед. Eco RI рестриктазы и выдерживают раствор еще 1 ч при 37 С, ДНК из раствора осаждают 2%-ным LiC104 в ацетоне. Осадок растворяют в 100 мкл буфера 1. К раствору добав- ляют по 100 пкмоль указанных выше f олигонуклеотидов, 20 ед. Т. ДНК-лига- зы и оставляют на 12 ч при 5°С. 10 мкл лигазной смеси используют для трансформации клеток E.doli IM 103. Колонию с Lac -фенотипом проводят через 4 пассажа. После каждого пассажа выделенную из биомассы рекомби- нантную плазмидную ДНК pFH 125 аналиGGATGCGCGTCGACAAGCTAGCTTGGATCCGCGTCATCCAGACGTCCTACGCGCAGCTGTTCGATCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTAA

а также между попарными сайтами эндо- нуклеаз рестрикции Fok I и Hga I противоположной полярности-сайты для эндонуклеаз рестрикции Sal GI, Асе I, Hind II и Bam HI;Д5

фрагменты размером 26, 34, 67, ПО, 147, 200, 242, 404, 432, 489,. 500 п.о. образующиеся после расщепления эндо- нукдеазой рестрикции lisp I;

фрагменты размером И, 80, 100, JQ 164, 260, 267, 290, 434, 457, 587 п.о., образующиеся после расщепления эндо- нуклеазой рестрикции Rsp I;

фрагменты размером 8, 88, 181, 244, 287, 616, 1244 п.о., образующи- 55 еся после расщепления эндонуклеаэой рестрикции Fok I;

вставку субфрагмента для клонирования no Sal GI и .Bam HI-сайтам полизируют Ban HI, Sal GI, Bsp I рестри- ктазамй., а также определяют нуклео- тидную последовательность полилинкера методом Максама-Гильберта. Клетки Е. coli, трансформированные плазмидой pFH 125, имеют Lac+ фенотип, который не изменяется с числом проведенных- пассажей. На 1000 клонов с1 указанным фенотипом приходится 990+10 при 95% уровня доверия.

Таким образом, предложенный вектор pFH 124 пригоден для получения фрагментов с произвольными липкими концами. Плазмиды pFH 123 и pFH 124 (ее производная) имеют высокую стабильность. После 4 пассажей не менее 95% клонов сохраняют исходный фенотип.

Формула изобретения

I. Вектор pFH 124 для получения фрагментов ДНК с произвольными липкими концами с Мол.мае. 1,8 Md, .размером 2684 п.о. и содержащий:

Pvu II - фрагмент ДНК плаэмиды pUC 18 размером 2364 п.о. с реллико- ном плазмиды pUC 18 и геном 0-лакта- мазы, определяющим устойчивость к ампициллину;

Pvu II - фрагмент ДНК плазмиды рМВ 124 размером 320 п.о., включающий часть модифицированного гена |5-галак- тозидаэы и синтетический полилинкер размером 42 п.о,, имеющий структуру

линкерной области;

емкость вектора от 12 до 413 п.о.;

штаммы-хозяева: штаммы Escherichia

coli с lac Z UM 15-фенотипом;

кратность клонируемого субфрагмента

(Зп+2).

715526438

смесью трансформируют клетки Е. coliк ампициллину с Lac - фенотипом и выIM 103, отбирают клоны, устойчивее -деляют вектор pFH 124.