Способ конструирования гена интерлейкина-2 человека Советский патент 1991 года по МПК C12N15/00 

(46) 07.05.91. Ьюл. I 17

(21)4382438/ 13

(22)19.02.88

(71)Всесоюзный научно-исследователь ский институт молекулярной биологии

(72)А.Н.Синяков, Н.К.Данилюк, О.И.Серпинский и М.А.Урмянова

(53)575.224.2; 577.2/048(088.8)

(56)ЕР 017000, С 12 N 15/00, 1987.

(54)СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ГЕНА ИН- ТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА

(57)Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии. Целью эобретения является упрощение способа. Разработан химико-ферментативный способ синтеза гена ннтерлейкина-2 человека, заключающийся в том, что синтезируют 16 частично комЬ-J лементарных поляиуклеотмдов длиной 30-40 нуклеотидных звеньев, которые затем попарно достраивают до полных дуплексов с помощью ДОК полинеразы (фрагмент Кленова) с последующим клонированием каждого из четырех фрагментов в плаэмидах pFHI23 н pFHI24, способных давать субфрагменты с произвольно эапланмрованшмчм липкими концами после гидролиза рекомбинантмой ДНК эндонуклеазой рестрикции Рок I, направленно собирают полученные фрагменты ДНК гена- IL-2 я плазмнде pFHI25.. 1 табл.

г

V)

Иэобретение относится к молекуляр-, ной биологии и биотехнологии, конкрег- но к получению рекомбинантньЬс ДНК, содержащих полные гены биологически активных веществ, методами генети-- четкой инженерии, и может найти применение в биотехнологии при создании , и аммов - продуцентов целевых продуктов.

Целью изобретения является упрощение способа.

Для достижения цели разработан способ синтева гена интерлейкина-2 человека, заключающийся в синтезе 16 частично комплементарных полинуклеоти- дов длиной 30-40 нуклеотидных звеньев, попарной репаративной достройке их до полных дуплексов с помощью ДНК- полимеразы (фрагмент Кленова) с последующим клонированием каждого из четырех фрагментов в.плаэмидах pFHI23

липкими концами после гидролиза ре- комбинантной ДНК эндонуклеазой рестрикции Fok I, последующей сборке полученных субфрагментов в плаэмнде pFH125.

Существенным отличием в предложенном конструировании является использование синтетических частично плементарных поликуклеотидо в длиной 30-40 нуклеотидных звеньев, позволяющих не(синтезировать полный дуплекс гена IL-2 и тем самым предоставляющих возможность экономить 30Z работы по химическому синтезу целевого газа. Существенным отличием является также использование для клонирования и получения субфрагментов плаэмнд рРН123 и pFH124, что позволяет однозначно собрать целевой ген из субфраги pFHI24, способных давать субфряг- менты с произвольно запланированными -

СЛ

сл

4ь

00

00

ю

ментов с паранее запланированными липкими копиями.

Пример I . Химический синтез нолинуклептмдов.

Синтез проводят твердофазным фос- фотрнэфнрным методом. В качестве носителя используют модифицированное стекло пористое СРП-10ОП. Наращивание олнгонуклеотидной цепи прово- дят от 3- к 5 -концу с помощью динуклеоэнддифосфатных производных (MeO)7TrNp (PhCI)Np(PhCT). Выделение нолевого продукта после деблокирования реакционной смеси проводят путем последовательных хроматографии на T.ichrosoTb RP18 сначала п 0,1 М триэтиламмопийацетате в градиенте ацетонитрило 15-40%. Затем раст-. вор выделенного триэтилполинуклео- тнда упаривают досуха, растворяют в 2,5 мл 80%-ной водной уксусной кислоты и выдерживают при комнатной температуре 45 мин. Раствор упаривают досуха, растворяют остаток в 1 мл дистиллированной воды и хромато- графируют на Lichrosorb RP18 в 0,05 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетоннтрила 5-20%.

,

Дуплексы для клонирования фрагмента Т. получают из полинуклеотидов (T-IV) (таблица). Для этого реакционную смесь, содержащую по 100 пмоль меченного у-Р 37АТР полннуклеотида (I) и фосфорйлированного холодным АТР полинуклеотида (II) в 100 мкл буфера 1 (60 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCli, 10 мМ 2-меркаптоэтанол) нагревают 10 мин при 50°С, охлаждают до 20°С, добавляют dNTP до концентрации 250 мкМ и 10 ед. ДНК-полимеразы 1 (фрагмент Кленова). Реакционную смесь инкубируют 30 мин при 20 С. ДНК-дуплекс осаждают ацетоном, со- держащим 2% LiCIO, промывают спиртом, сушат на воздухе, осадок растворяют в воде. Полученный дуплекс расщепляют 50 ед, эндонуклеазы рестрикции PstI в 200 мкл буфера 2 (20 мМ трис-HCl, рН 7,8, 10 мМ MgCl 10 мМ 2-меркаптоэтанол), содержащего 50 мМ NaCl, в течение 3 ч при 37°С. Аналогично получают дуплекс из ло- линуклеотидов (III и IV), который расщепляют обработкой 60 ед, эндо- нуклеаэы рестрикции Bam HI в 200 мкл буфера 2, содержащего 100 мМ NaCl, в течение 12 ч при , Оба рестрик

5

0

та втигеляют г помощью ггль-члсктрофо- реза в 8% ИААГ.

Реакционную гмесь, содержащую по 2 пмоль приготовленных дуплексов и 0,25 пмоль векторной ЛИК, полученной из pFH124 совместным ряпчеплением эндонуклеаз рестрикции Ram HT(50 мкл раствора, содержащего буфер 2 и 100 мМ М{;С10, при 37°Г 1 ч) и Pst Т (50 мкл буфера 2 и 50 мМ NaCl при 37°Г I ч), обрабатывают 8 ед. ДИК ли- газы ф,-1га-Т4 в 30 мкл буфера 3 (20 мМ трис-НС. рН 7,5, 10 мМ MgCl,, 10 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,25 мМ АТФ) в течение 16 ч при 10°С. Реакционную смесь используют для трансформации клеток E.coli JM103. Суспензию клеток после трансформации высевают на 1,5%- ный агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл X-gal. Из колоний L имеющих lac г -фенотип и гибридизую- щихся с Рзг-меченными зондами, выделяют щелочным методом ДНК, которую дополнительно анализируют с помощью Bsp I, Eco RI и Pst I-гидролиэа. Структуру рекомбинантной ДНК pFLlAI подтверждают модифицированным методом Максама-Гилберта о

Бактерии E.coli JMI03, содержащие плазмиды рРЫ41 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл LBJ среды. Для получения целевого субфрагмента I, кодирующего часть гена человеческого IL-2 с заранее запланированными липкими концами, 60 мкг ДНК плазмиды pFL141 в 300 мкл буфера 1 и 50 мМ NaCl обрабатывают 30 ед. эндонуклеаэы рестрикции Pst I 1 ч при 37°С, а затем 30 ед. эндонуклеазы рестрикции Fok NI в тех же условиях- Целевой фрагмент длиной 100 нуклео- тидных пар выделяют с помощью электрофореза в 5% ПААГ.

Пример 2, Получение ДНК субфрагме нта II, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствующую 32-60 аминокислотам человеческого IL-2.

Аналогично примеру 1 из полинуклеотидов (V-VIII) фрагмента II получают дуплексы для клонирования. После репаратнвной достройки полинуклеотидов (V и VI) в описанных выше условиях полученный дуплекс обрабатывают 50 ед. эндонуклеазы рестрикции Sal GI в 200 мкл буфера 1, содерядщего 150 мМ NaCl в течение 12 ч при 37°Г:.

Bsp If Eco RI и Pst эндонуклеаэ рестрикции. Структуру полученной реком- бинатной ДНК pFL137 подтверждают методом Максама-Гилберта.

Колонии,, имеющие плаэмиды со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл LB-среды. Для получения целевого субфрагмента IV с эаранее запланированными липкими конца jg эондами на 1I.-2, выделяют ДНК, обо20

м 60 мкг ДНК плаэмиды pFL137 в 300 мкл буфера 1, содержащего 150 мМ NaС1, обрабатывают 60 ед„ эндонуклеа- эы рестрикции Sal GI 3 ч при 37 °С. Реакционную смесь осаждают 2%-ннм раствором LiCLO, Лромывают этиловым спиртом, сушат. Остаток растворяют в 100 мкл буфера I, содержащего 50 мМ NaCl и гидролиэуют 40 ед. эндонукле- азы рестрикции Fok I 1 ч гтри , Целевой фрагмент длиной I20 нуклео- тидных пар выделяют с помощью электрофореза в 5% ПААГ.

Пример 5. Получение гена человеческого IL-2 в составе плазмиды 25 pFH12i.

5 мкг плаэмиды pFHI25 гидролиэуют последовательно рестриктазой Sal GI в 50 мкл буфера 2, содержащего 150 мМ NaCl, 1 ч при 37°С, затем рестрик- таэой Pet I.B 50 мкл буфера 2 и 50 мМ NaCl в тех же условиях. Смесь из 0,5 пмоль Pet I - Sal. GI векторной ДНК и по 5 пмоль I, II, III, IV субфрагмента (примеры 2, 3, Л, 5 соответ-,- ственно), взятых в эквимолярных соотношениях, обрабатывают 15 ед. Т4 ДНК- лига зы в описанных выше условиях

эначенную pEXIL-2,- которую анализируют с помощью Bsp I, Pst I-гидролнэа,

Активность рекомбинантного IL-2 была оценена по количеству включенj5 ного С3Н тимидина в ДНК первичной культуры клеток мышинных лимфоцитов, в соответствии с известным методом. Клетки E.coli JM83, содержащие pEXIL-2,выращивают в 5 мл LB-cpe- ды при 37 °С до . Клетки собирают центрифугированием, затем ре- суспендируют в 7 мл среды ХЕНКС, содержащей 1.мг/мл лизоцима, и выдерживают 30 мин при 5°С. Смесь трижды замораживают, озвучивают и центрифугируют о Супернатант фильтруют через Millipore11 фильтр (0,2 мкм) 100 мкл клеточного супернатанта 2-го разведения, добавляют к 100 мкл ин30 ДУЦированной клеточной культуры (по- севая концентрация 5-8 клеток (мл) и термостатируют 24 ч при в Атмосфере 5Z С04 0,25 мкКи Н-тими- дина вводят в реакционную смесь и термостатируют еще 4 ч в тех же условиях. Клетки собираются на фильтре Millipore (0,45 мкм), промывают 0,01 М KtHP04 (рН 7,5) с 0,1 М NaCl. Количество включенного 3Н-гимндииа

10 мкл смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli ЛМЮЗдд измеряют по Черепкову, используют Из колоний, гнбридиэующихся с Р а-ме- счетчик Mark III. ченными олигонуклеотидами II и IV фрагментов, выделяют ДНК и анализируют ее с помощью Bsp I, Pst I, Eco

Лизаты клеток E.coli JM83, содержащие pFXIL, достоверно вызывают пролиферацию мышиных лимфоцитов, т.е. об50

RI эндонуклеаэ рестрикции. Структуру ладают активностью IL-2, Полученные рекОмбннантной ДНК, содержащей синтезированный ген IL-2 и обозначенной pIL-2, подтверждают модифицированным методом Максама-Гилберта.

Пример 6. Определение биоло- гической активности синтезированного гена IL-2.

1 мкг ДНК плаэмиды pIL-2 гидролиэуют рестриктазой Pet I в описанных выше условиях. ДНК осаждают ацетоном, содержащим 27. LiCLA, , высуиенный осадок растворяют в 30 мкл буфера I, добавляют 5 ед..ДНК-полимеразы 1 (фраг- мент Кленова) и выдерживают 15 мин

55

данные свидетельствуют о биологической полноценности синтезированного гена человеческого IL-2,

Предложенный способ получения ген IL-2 имеет существенные преимущества. Вследствие применения на.стадии получения субфрагментов длинных частично комплементарных полинуклеотидо и использования репаративной дострой ,ки их до полных дуплексов, удаётся значительно сократить работу по хими ческому синтезу и выделению нуклео- тндного материала. Разбивка гена на субфрагменты дает возможность отдель

при 20°С. Реакционную смесь прог( - вают 2 мин при 70°С, добавляют АТФ . до концентрации 100 мкМ, 5 ед. ЛПК ( лигаэы и инкубируют 12 ч при 5°С, 2 мкл реакционной смеси используют для трансформации клеток E.coli JM83.

Из колоний, имеющих lac /.-фенотип и гибридиэующихся с Рл -меченными

измеряют по Черепкову, используют счетчик Mark III.

Лизаты клеток E.coli JM83, содержащие pFXIL, достоверно вызывают пролиферацию мышиных лимфоцитов, т.е. обладают активностью IL-2, Полученные

данные свидетельствуют о биологической полноценности синтезированного гена человеческого IL-2,

Предложенный способ получения ген IL-2 имеет существенные преимущества. Вследствие применения на.стадии получения субфрагментов длинных частично комплементарных полинуклеотидов и использования репаративной дострой ,ки их до полных дуплексов, удаётся значительно сократить работу по химическому синтезу и выделению нуклео- - тндного материала. Разбивка гена на субфрагменты дает возможность отдель515543826

Дуплекс, полученный из полннукле-ч и 0,25 пмоль векторной ДНК, полу- отндов (VII и VIII), расщепляют рбра- ценной из pFH123 совместным расщепле- боткой 50 ед, эндонуклеазы рестрикции нием эндонуклеаэами рестрикции Ват И1 Bgl II в 200 мкл буфера 1, содержащего, и Sal GI (условия приведены выше), 50 мМ NaCl, в течение 12 ч при 37°С. обрабатывают 10 ед. ДНК-лнгазы в опи- Оба рестрнкта выделяют с помощью гель- санных выше условиях. Лигаэной электрофореза в 8% ПААГ,

Реакционную смесь, содержащую по 2 пмоль приготовленных дуплексов и IQ 0,25 пмоль векторной ДИК, полученной из pFH124 совместным расщеплением эндонуклеаэами рестрикции Ват I и Sal GI (условия приведены выше) обрабатывают 8 ед. ДНК-лизагы в описанных выше 15 тверждают модифицированным методом условиях Лигазной смесью трансфер- Максама-Гилберта.

мируют клетки E.coli JM103. Из коло- Колонии, имеющие плаэмиды pFL912 ний, имеющих lac Z фенотип, гибриди- со вставкой требуемого размера, выра- зующихся с 3 Р-меченными зондами, щивают в 100 мл LB-среды. Для получе- выделяют ДНК и дополнительно анализи- 20 ния целевого субфрагмента III с эара руют ее с помощью Bsp I, Eco RI и нее запланированными липкими конца- Pst I-гидролиза. Структуру рекомби- ми 60 мкг ДНК ллазмиды в . нантной ДНК pFL подтверждают модифи- 300 мкл буфера I, содержащего 50 мМ цированным методом Максама-Гилберта. NaCl, обрабатывают АО ед. .эндонуклеа- Бактерии E.coli, содержащие плаз- 25 зы рестрикции Fok I 1 ч при 37°С. Цег

левой фрагмент длиной 118 нуклеотид- ных пар выделяют с помощью электрофореза в 5% ПААГ.

смесью трансформируют клетки Е.со li JM103. Из колоний, имеющих lac 7,-фенотип, гибридиэующихся с Р-ме- ченными зондами, выделяют ДНК и дополнительно анализируют ее с помощью-. Bsp I, Eco RI и Pst-гидролиза. Структуру рекомбинантной ДНК pFL912 подПример 4. Получение ДНК сув35

миды pFL581 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл LB-среды. Для получения целевого субфрагмента II с заранее запланированными липкими концами 60 мкг ДНК плазмн- 30 Фрагмента IV, которая имеет аминокис- ды pFL581 в 300 мкл буфера 1, содер- лотную последовательность, соответствующую 98-133 аминокислотам человеческого IL-2.

Аналогично примеру 2 из полинукле- отидов (XIII-XVI) субфрагмента IV получают дуплексы для клонирования. После репаративной достройки полинук- леотидов (XIII и XIV) в описанных выте условиях полученный дуплекс ствующую 60-98 аминокислотам челове- п обрабатывают 40 ед. эндонуклеазы ре- ческого .стрикции Sau ЗА в 200 мкл буфера 1,

Аналогично примеру 2 из полинукле- содержащего 50 мМ NaCl, в течение отидов (IX-XII) субфрагмента III 12 ч при 37 С. Дуплекс, полученный из получают дуплексы для клонирования, полинуклеотипов (XV и XVI), расщеп- Поспе репаративной достройки полинук- 45 лягот эндонуклеазой рестрикции Sal GI леотидов (IX и X) в описанных выше в описанных выше условиях, условиях полученный дуплекс обраба- Реакционную смесь, содержащую по тывают 50 ед. эндонуклеазы Bgl II в 2 пмоль приготовленных дуплексов н 200 мкл буфера 1, содержащего 50 мМ 0,25 пмоль векторной ДНК, полученной NaCl, в течение 12 ч при 37°С. Дул- из pFH123 совместным расщеплением

жащего 50 мМ NaCl, обрабатывают 40 ед, эндонуклеазы рестрикции Fok I 1 ч при 37°С. Целевой фрагмент дли- ., ной 87 нуклеотидных пар выделяют с помощью электрофореза в 6% ПААГ.

Пример 3, Получение ДНК субфрагмента III, кодирующего аминокислотную последовательность, соответлекс, полученный из полинуклеотидов (XI и XII), расщепляют обработкой 100 ед. эндонуклеаэы рестрикции Sal GI в 200мкл буфера I, содержащего 150 мМ NaCl, в течение 12 ч при 55 37еС. Оба рестрикта выделяют с помощью гель-электрофореза в 8Z ПААГ. .1. Реакционную смесь, содержащую по 2 пмоль приготовленных дуплексов

эндонуклеаэами рестрикции Bam HI и ASal GI (условия приведены выше), обрабатывают 3 ед. Т4 ДНК-лигазы в описанных выше условиях. Лигазной смесью трансформируют клетки. E.coli JMT03. Из колоний, имеющих lac Z -фенотип, гибридиэующихся с Р 1-меченными зондами, выделяют ДНК и дополнительно анализируют ее с помощью

и 0,25 пмоль векторной ДНК, полу- ценной из pFH123 совместным расщепле- нием эндонуклеаэами рестрикции Ват И1 и Sal GI (условия приведены выше), обрабатывают 10 ед. ДНК-лнгазы в опи- санных выше условиях. Лигаэной

тверждают модифицированным методом Максама-Гилберта.

смесью трансформируют клетки Е.со li JM103. Из колоний, имеющих lac 7,-фенотип, гибридиэующихся с Р-ме- ченными зондами, выделяют ДНК и дополнительно анализируют ее с помощью-. Bsp I, Eco RI и Pst-гидролиза. Структуру рекомбинантной ДНК pFL912 подПример 4. Получение ДНК сувгмента IV, которая имеет аминокис- ную последовательность, соответующую 98-133 аминокислотам человекого IL-2.

35

п

содержащего 50 мМ NaCl, в течение 12 ч при 37 С. Дуплекс, полученный и полинуклеотипов (XV и XVI), расщеп- лягот эндонуклеазой рестрикции Sal GI в описанных выше условиях, Реакционную смесь, содержащую по 2 пмоль приготовленных дуплексов н 0,25 пмоль векторной ДНК, полученной из pFH123 совместным расщеплением

эндонуклеаэами рестрикции Bam HI и ASal GI (условия приведены выше), обрабатывают 3 ед. Т4 ДНК-лигазы в описанных выше условиях. Лигазной смесью трансформируют клетки. E.coli JMT03. Из колоний, имеющих lac Z -фенотип, гибридиэующихся с Р 1-меченными зондами, выделяют ДНК и дополнительно анализируют ее с помощью

но очистить их методом молекулярного клонирования и плаэмидах и pFMI24, наработать в достаточном количестве и после гидролиза эндонук- леазой рестрикции Fok I выделить субфрагменты с уникальными липкими

10

Способ конструирования гена интер- лейкина-2 человека, предусматривающий синтез гена интерлейкина-2 человека путем ферментативной сгаивки составляющих его фрагментов и субклонирова- нне гена в составе плязмидной ДНК, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, фрагменты

концами, способными направленно собираться в целевой ген IL-2. Такой прием позволяет избежать трудоемкого и ненадежного последовательного лигиро- вания коротких олигонуклеотидов в полный дуплекс гена IL-2.

Такой подход не накладывает ограничений на использование определенных j получают из частично комплементарных кодов аминокислот. Это является допол- полинуклеотидов при попарной их нительным преимуществом способа, поз- репаративной достройке до полных дуп- воляющим осуществить направленную за-лексов с помощью ДНК-полимеразы

мену кодонов аминокислот, редко ис-I E.coli-фрагмента Кленова с последуюпользуеных у прокариот. Синтезирован- рд шим клонированием полученных дуплек- ный ген может эффективно экспресси-сов в составе плазмид рРН123 и pFH124

роваться как в прокариотических, так и и выделением фрагментов с эапланиро- в эукариотнческих векторах. Наличие

ванными несимметричными липкими

промежуточных субфрагментов гена

IL-2 с уникальными липкими концами 25

важно само, по себе, так как открываРекомбинлнтная плазмидная ДНК pTL-2...

концами с помо рикции Fok I, ведут в состав

3 к- б1554382

РТ возможность получения разнообразных аналогов природного гена IL-2.

Формула изобретения

Способ конструирования гена интер- лейкина-2 человека, предусматривающий синтез гена интерлейкина-2 человека путем ферментативной сгаивки составляющих его фрагментов и субклонирова- нне гена в составе плязмидной ДНК, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, фрагменты

получают из частично комплементарных полинуклеотидов при попарной их репаративной достройке до полных дуп- лексов с помощью ДНК-полимеразы

и выделением фрагментов с эапланир

ванными несимметричными липкими

концами с помощью эндонуклеазы рестрикции Fok I, а субклонирование гена ведут в составе плазмиды pFHI25.