Способ получения искусственного гена интерферона @ 2 человека и способ получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к биоргани чёской химии, генетической инженерии и микробиологии. Изобретение относится к получению искусственного гена интерферона ct. 2 человека, аналогов и прототипа этого способа в литературе не обнаружено. Изобретение касается также способ получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синте зом. Известен способ получения полипеп тида с активностью интерферона, оснр ванный на использовании лейкоцитов крови, которые Яюсле индукции вирусо продуцируют интерферон ОНедостатками этого способа являются низкий выход продукта, высокая стоимость сырья и ограниченность его источников, что определяет высокую стоимость препарата. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получе ния полипептида, обладающего активно стью интерферона, микробиологическим синтезом Г2j, Этот способ обеспечивает возможность получения продукта в больших количествах со сравнительно высоким выходом из дешевого исходного сырья. Однако недостатком данного способа является то, что копия гена из организма человека не является оптимальной для наработки кодируемого им полипептида в бактериальной клетке, по скольку первичная последовательность эукариотического гена содержит кодоны, характеризующиеся низким уровнем трансляции в бактериальной клетке, что снижает выход продукта генети ческой экспрессии. Кроме того, копия природного .гена не приспособлена для создания штамма-продуцента, так как для ее использования требуется проведение ряда перестроек первичной структуры с помощью методов генетической инженерии и химического синтеза. Целью изобретения является получение искусственного гена интерферона рС2 человека, а также увеличение выхода полипептида с активностью интерферона. Поставленная цель достигается тем что согласно способу получения искусственного гена интерферона оС 2 человека при помощи фосфотриэфирного метода из мононукдеотидов синтезируют олигонуклеотиды длиной 9-15 звеньев, полученные олигонуклеотиды фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы, олигомеры сшивают ДНК-лигазой в 7 фрагментово длиной от 28 до 99 пар оснований, далее их клонируют, плазмидами pBR 322, pBR 322 Mpt 3 и pUR 222, N-концевую половину гена собирают последовательной сшивкой фрагментов 1-4 по липким концам в составе векторной молекулы, -причем липкие концы сайтов Крп I и Вам HI удаляют ДНК-полимеразой I и S. -нуклеазой, а С-концевую половину гена собирают после клонирования одновременной сшивкой фрагментов 5-7 с определенной последовательностью нуклеотидов, затем две половины гена сшивают в полный ген интерферона оС 2 человека внутри- или межмолекулярдым способом. Кроме того, согласно способу получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом путем встройки искусственного гена интерферона оС 2 человека в векторную плазмиду, наработки целевого продукта трансформированным микроорганизмом и вьщеления целевого, продукта при встройке искусственного гена интерферона об 2 человека используют лакгозный оперон Е„ coli в составе векторной плазмиды, а -в качестве векторной плазмиды используют гибридную плазмиду pLelF (ptac) или pLelF-BI. На фиг. 1 изображены аминокислотная и нуклеотидная последовательности интерферона и искусственного гена интерферонаоС2 (отличия-от природной последовательности нуклеотидов в значащей цепи подчеркнуты); на фиг. 2 нуклеотидная последовательность синтетических фрагментов гена (знаками Л указано разделение цепей фрагментов на олигонуклеотиды); на фиг. 3 схема сборки N-концевой половины гена (7-250) из фрагментов 1-4 путем последовательной сшивки фрагментов по липким концам в составе векторной молекулы с последующим удалением сайтов КРп I и Ват HI; на фиг. 4 схема сборки С-концевой половины гена (251-5U1) из фрагментов 5-7 путем одновременной спшвки фрагментов после клонирования и встройки в векторную молекулу; на фиг. 5 - первый вариант получения векторных плазмид и сборки полного гена из половин внутримолекулярной стыковкой половин гена в векторной ДНК; на фиг. 6 - второй вариант получения векторной плаз МИДЫ и сборки полного гена интерферона межмолекулярной сшивкой фрагмен тов при одновременной вставке их в векторную ДНК; на фиг. 7 - схема получения рекомбинантной плазмиды для экспрессии искусственного гена интер ферона ОС 2 человека с использованием плазмидного вектора psK 95.1; на фиг. 8 - то же, с использованием плазмидного вектора pBR-Bl. . Предлагаемый способ синтеза позволяет получить ген с любой напередзаданной структурой. Синтез гена интерферона ОС 2 человека и его свойства ранее в литературе не описаны. Ис кусственный ген интерферона оС 2 человека, первичная структура которого представлена на фиг. 1, кодирует полипептид длиной 165 аминокислотньк остатков, соответствующий природному интерферону оС2 человека, однако является химическим соединением, принципиально отличающимся от природного гена по нуклеотидиому составу и первичной структуре. Это отличие достигается за счет введения в процессе синтеза кодирующих триплетов, обеспечивающих максимальную экспрессию гена в клетках Е. .coii в результате более эффективной трансляции мРНК. Для синтеза гена его структуру разбивают на 7 фрагментов длиной до 100 пар оснований (фиг. 2). Для удобства клонирования синтетические фрагменты содержат на концах сайты, узнавания рестриктаз, которые при необходимости удаляют из них ни этапе сбсрки гена. Каждьй. из фрагментов в свою очередь, разбивают на олигонуклеотиды длиной 9-15 звеньев (фиг. 2). Для обеспечения однозначного сшивания олигомеров ДНК-лцгазой по стратегии Кораны разбивку фрагмен тов проводят с помощью ЭВМ по специально разработанной программе. Схему синтеза олигонуклеотидов рассчитьшаю с учетом частот встречаемости различ ных повторов в составе последователь ности нуклеотидов гена, а также с то ки зрения минимизации затрат исходно го нукдеотидного материала, что значительно снижает трудоемкость синтеза. 764Способ получения гена, включающий молекулярное клонирование после лигазной сшивки в качестве стадии очистки и, характериэации, обеспечивает получение фрагментов гена в индивидуальном виде в необходимом количестве. Дпину фрагментов выбирают оптималь ной с точки зрения лигазной сшивки из . олигонуклеотидов. Такой подход, впервые предложенный и использованный и в данном изобретении является универсальным приемом для синтеза генома любой произвольной длины и последовательности. Химический синтез олигонуклеотидов проводят модифицированным фосфотриэфирным методомв растворе и на полимерном носителе. Олисонуклеотиды фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы, 4-6 олигомеров сшивают действием ДНК-лигазы в дуплексные блоки, из которых затем собирают фрагменты для промежуточного клонирования Кпонирование фрагментов после лигазной сшивки осуществляют в составе плазмид pBR 322, pBR 322 mpt 3 и pUR 222, как показано на фиг. 3 и 4, Структуру рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты гена интерферона, подтверждают :методом Максама-Гилберта. Сборку гена проводят в два этапа. На первом этапе из фрагментов 1-4 и 5-7, соответственно, синтезируют две половины гена. На следующем этапе половины гена сшивают в полный ген, который затем встраивают в вектор ддя экспрессии. Схема сборки М-концевой половины генй представлена на фиг. 3. Сборку проводят путем последовательной сшивки фрагментов по липкимкона ам в составе векторной молекулы. На последних стадиях с помощью ДНКполимеразы I и S -нуклеазы удаляют липкие концы сайтов Крп и Ват HIj не входящих в состав гена и использующихся для удобства клонирования и сшивки фрагментов. С-концевую половину гена собирают путем одновремен : ной сщивки фрагментов 5-7 после клр-w «ирования, как показано на фиг. 4, и последующей встройки в векторную плазмвду 222.. Для осуществлейия целого гена лейкоцитарного интерферона из половин необходимо сконструировать векторные плазмиды. С этой целью сначала в плазмиде pBR 322 проклонируют по EcoRI-сайту Синтетический линкерный додекануклеотид AA.TTTAGATCTA. Полученную таким образом плазмиду рРК14, обеспечивающую устойчивость Е. coli к тетрациклину и ампициллину, отбирают по наличию сайта рестриктазы Bgl II и отсутствию сайта EcoRI. Клонированием по BamHI-сайту додекануклеотида GATCCGAATTCG, содержащего EcoRI-сайт получают необходимую векторную плаз- МИДУ рРК16. о ,Место соединения половин гена не является сайтом эндонуклеазы рестрик ции, поэтому сшивку половин необходи мо приводить по затупленным концам (удалением Hind Ill-выступающего кон ца N-концевой половины гена и заполн нием EcoRI-выступающего конца С-пол вины гена). Такую сборку осуществляют двумя способами (фиг. 5 и 6. Согласно первому способу стыковку половин проводят внутримолекулярно В составе плазмидного вектора (фиг. 5) С этой целью сначала в плазмиде рРК1 по сайтам Bglll и Hind III реклонирую N-кснцевую половину гена, выделенную .из плазмиды pLelF (7-250). В получен ную таким рбразом плазмиду pLelF (7-250).2 вместо фрагмента EcoRI Sal 1-287 встраивают С-концевую половину структурного гена, В результате полу чают пяазмиду pLelRtl, в которой обе половины гена находятся в нужной для стыковки ориентации и .разделены последовательно в 352 нуклеотидные пары. Для окончательной сборки гена ДНК плазмиды pLelFtl гидролизуют рестриктазой Hind III, выступающие кон цы удаляют мягкой обработкой Si-нуклеазой, после чего ДНК подвергают гидролизу рестриктазой EcoRI и достраивают липкие концы при помощи ДНК-полимер азы I Е. cotj. (фрагмент Кленова . Полученную таким образом ДНК обрабатывают Т4 ДНК-лигазой в условиях сшивки по тупым концам, после чего используют для трансфор- мации клеток Е. coti HBIOI или ВМН 7lib. Отбор трансформантов проводят гибридизацией колоний на нитроцеллюлозных фильтрах. В качестве зонда для гибридизации используют пентадекануклеотид СТООАСАААТТСТАС, Строение полученной таким образом плазмиды подтверждают рестриктным анализом и анализом нуклеотидной последовательности вставки. Другой способ заключается в выделении соответствующим образом подготов ленных половин структурного гена и одновременной вставке их в векторную ДНК.,В этом случае в качестве вектора используют большой Bgll Sal I-фрагмент плазмиды рРК14, который выделяют электрофорезом в 5%-ном полиакриламидном геле (ПАГ;. Чтобы получить N-концевой фрагмент, ДНК плазмиды pLelF (7-250), 2 сначала расщепляют рестриктазой Hindlll, а после обработки S -нуклеазой гидролизуют рестриктазой Bgill, и малый фрагмент вьщеляют электрофорезом в 5%-ном ПАГ. Аналогичным образом для получения С-концевого фрагмента ДНК плазмиды pLelF (251-501) гидролизуют рестриктазой EcoRI, липкие концы достраивают ДНК-полимераЗОЙ IE. coii после чего гидролизуют рестриктазой Sail, и фрагмент вьщеляют электрофорезом в 5%-ном ПАГ. Эквимолярные количества половин сшивают ДНК-лигазой с векторным фрагментом,, и полученной ДНК трансформируют клетки Е. coli ВМН 7118. Отбор рекомбинантных плазмид проводят перекрестной гибридизацией с фрагментами N- и С-концевой половины структурного гена, а также с пентадекануклеотидом CTGGACAAATTCTAC. Для получения рекомбинантной ДНК, содержащей полный структурный ген лейкоцитарного интерферона оС 2 человека, гидролизованную рестриктазой В gZlI плазмиду pLelFt 17 сшивают с избытком нефосфорилированного 22-звенного олигонуклеотида GATGACACAGGATCCATGTGT, .содержац;его сайт эндонуклеазы Ват HI и начало гена, и полученной ДНК трансформируют компетентные клетки E.co2i (фиг. 6). Для того, чтобы искусственный ген .лейкоцитарного интерферона ot 2 чело-века мог экспрессироваться в бактериальной клетке, необходимо снабдить его регуляторным сегментом ДНК, содержащим участки инициации транскрипции и трансляции. В качестве такой регуляторной ДНК выбирают промоторнооператорный фрагмен лактозного оперона Е.соН (содержит промотор lacUV 5, оператор и сайт связывания рибосомы), под контролем которого протекает эффективная экспрессия гена -галактозидазы в бактериальной клетке. В качестве одного из вариантов векторной системы, для экспрессии (фиг. 7) используют встройку гена в состав плазмидного вектора pSK95:. 1 (производное pBR322, содержащее lacUV 5-промотор Е. coll) путем сшивки ДНК-лигазой смеси вектора PSK95.1, обработанного рестриктазами EcoRI и Sat I, гена интерферона, выделенного из состава плазмиды pLelFtl по сайтам Bg lI-Sa I, и синтетического линкера, состоящего из олигонуклеотидов AATTCATGTGT и GATCACACATAG. В полученной в результате этого плазмиде pLelF (Ptac) lac промотор оказывается расположенным перед геном в. положении, наиболее благоприятном для экспрессии. В другом варианте (фиг. 8) в качестве вектора для экспрессии исполь зуют тшазмиду рВК-В1, отличающуюся от pBR 322 тем, что она содержит перед BamHI-сайтом 90-нуклеотидньй про моторный фрагмент лактозного оперона Клонирование в PBR-BI искусственного гена интерферона (вьщеляют из плазми ды pLeIFT3) по сайтам BamHI и Sal I приводит к плазмиде pLelF-BI, в кото рой экспрессию синтетического гена лейкоцитарного интерферона осуществл ют под к рнтролем двух природных промоторов (Ptet и Flac). Экспрессия гена интерферона ct- 2 характеризуется в международных един цах активности интерферона в лизатах - полученных после разрушения клеток E.coli,.несущих гибридные плазмиды pLelF (Plac) и PLelF-Bi. Способ получения полипептида с ак тивностью интерферона осуществляют следующим образом. Химический состав олигонуклеотидо проводят, исходя из нуклеозид-3 -фос фатов, защищенных по гетероциклическим основаниям (кроме Т) и фосфорному остатку,. Для защиты аминогрупп гетероЦиклов используют бензоильную группу для,А и С и изобутиральную группу для G. фосфатный остаток защищается п-хлорфенильной и |)-цианэтильной группами, З -ОН-группы диметокситритильной или монометокситритильной группами. В качестве кон денсирующего реагента используют триизопропил- или мезитшхенсульфотет разолид, в качестве полимерного ноЬи теля - полистирольный гель с 2% поперечных сщивок. Удаление 5-концевых моно- и диметокситритильных групп при синтезе в растворе и на носителе -проводят с помощью 10% ТХУ или 2% бензолсульфокислоты, удаление З-Р-защитной цианэтильной группы - с помощью раствора триэтиламина в ацетонитриле или водном пиридине. Полное удаление защитных групп проводят обработкой бензальдоксиматом тетраме- тилгуанидия (или лития) и/или аммиаком и далее 80%-нойуксусной кислотой. , . Промежуточные фосфортриэфиры. вы- , деляют колоночной хроматографией на сидикагеле в хлороформе или в системе с обращенной фазой на силанизированиом силикагеле в водном диоксане. Деблокированные олигонуклеотиды вьщеляют высокоэффективной колоночной хроматографией и метят с помощью г. 32т,1 лт 32i U - - ТФ и полинуклеотидкиназы, для анализа и последующей сшивки ДНК-лигазой. Для этого к смеси оли гонукпеотидов, входящих в- состав син тезируемого фрагмента, за исключением 5 -концевых, добавляют 1/10 объема 10 X лигазного буфера (200 мМ трис-НСг, рН 7,5, 100 мМ Mg Cl , ; 100 мМ меркаптоэтанол 1-2 мкКи АХФ и соответствующее количество полинуклеотидкиназы (из расчета 1 ед. фермента включает 1 нмоль за 30 мин при 37°С), Реакционную смесь инкубируют .30 мин при ,, затем добавляют Юткратный мольный избыток АТФ (по отношению к общему количеству 5 -концов и инкубируют еще .30 мин. Реакцию останавливают добавлением 1/10 объема ЮОмМЭДТА .: и смесь вьщерживают 5 мин при 73 С. После остывания добавляют 5 -концевые олигонуклеотиды и 1/10 объема 100 мМ Mg , БуферньЙ состав для сшивки восстанавливают с помощью раствора, .содержащего 200 мМ трисНСе, рН 7,5, 100 Mtl Mg и 100 м14 меркаптоэтанола, и добавляют лигазу до. концентрацииЗО-100 нМ.. Сшивку проводят либо 4-18 ч при 10-15 с, либо 3 .4 при комнатной температуре, добавляют 25 мкл ЗМ ацетата натрия, доводят объем водой до 250 мкл, добавляют РНК до суммарной концентра1ЩИ 50-100 мкг/мл и 750 мкл этанола. Раствор перемещивают и замораживают в ясидком азоте.-После оттаивания «смесь центрифугируют. Осадок ресус- ендируют в250 мкл 0,3 М ацетата атрия, рН 7,0, я переосаждают. бса-;

Док промывают этанолом и высушивают в вакууме, Распределение.продуктов сшивки ДНКлигазой проводят в 10-20 -ном полиакриламидном :геле, содержащем или не со.держащем мочевину (акрнламид-бисакрил амид 1У:1, электронный буфер 50 мМ трис-борат, 1 мМ ЭДТА, рН «,3; размером 20x40x0,06 см, либо 10x20x0,06 см при градиенте напряжения 30-50 В/см в течение 1,5-3 ч.

Местоположение продукта на геле . выявляют радиоавтографией с использованием пленки РМ-1 и усиливающего экрана в течение 1-2 ч..

Полосу, соответствующую продукту спивки, вьфезают из геля, элюирзлот электрофоретическим способом в течение 3-5 ч при Л 00-150 В и концентри-. руют на диализной пленке или ионообменной бумаге DE-81. Удаление продукта с бумаги производят промывкой 4x25 мкл 1 М NaCl и 7М мочевины и продукт обессоливают на колонке 0,3х х20 см с биогелем Е-4 в буфере 1 мМ трис-НСе, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА. Средний выход на стадии лигазной сшивки составляет 50-90%.

Клонирование синтетических фрагмен„тов после ДНК-лигазной сшивки проводят в плазмидах pBR 322, pUK 222 и pBR 322 rapt 3..

В типичном эксперименте к 0,2 мкг векторной молекулы добавляют 1-2 пмоля 5 -фосфорилированного фрагмента и лигируют как описано.

В случае получения плазмиды pLelF (Plac) в реакционную смесь добавляют по 20 пмолей нефосфорилированных по 5 -концу линкерных олигонуклеотидов 5 -AATTCTATGTGT и 5GATCACACATAG. Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli, обработанные Сп С Ц и высеивают на 1,5%ЬВ-агар содержаний 20 мкг/мл ампициллина(а также 10 М изопропилтиогалактозида и 40 мкг/мл X-Gal при клонировании в .плазмиде pUR 2.22)..

Выделение плазмидных ДНК для клонирования и гидролиз эндонуклеазами рестрикции EcoRI, BamHI, Sat I, Hindlll, Bgll Sau За, EcoRII, Bspl, Mspl, Pst I и Kpnl проводят стандартным способом. В случае использования эндонуклеазы EcoRII плазмидную ДНК . выделяют из штамма В 834. Рестрикционные фрагменты разделяют электрофорезом в 4-8Z-HOM полиакриламидном

геле. Фрагменты ДНК из геля выделяют методом электроэлюции и концентрируют, как описано.

Выступающие 5 -концы удаляют с помощью экзрнуклеазы,S. Для этого к 5 мкг ВажНХ-гидролизата ДНК плазмиды pl.t N4 в 200 мкл буфера, содержащего 0,5 М NaCt, 30 мМ NaAc, plj 4,8, 3 мМ ZnSO, добавляют 10 ед. Н -нуклеазы и инкубируют 30 мин при 12с. Затем фермент удаляют экстракцией нейтральным водным фенолом (рН 8,0) и ДНК осаждают спиртом.

Выступающие З-концы ДНК удаляют с помощью ДНК-полимеразы I E.coti (фрагмент Кленова). Для этого 2 мкг плазмиды pLFNI, гидролизованной эндонуклеазой Kpnl, инкубируют 40 мин. при 12 С в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НС., рН 7,5, 10 мМ Mg Ci, 10 мМ меркаптоэтанол, 0,05 мМ каждого сСАТФ, оССТФ, crCGTO и. оСТТФ и 5 ед. ДНК-полимеразы. Белок удаляют экстракцией фенолом и ДНК высажиaajoT спиртом. Эти же условия используют Для превращения липких концов в тупые на стадии сборки полного гена из половин.

Отбор трансформантов, содержащих необходимый фрагмент, проводят с помощью метода гибридизации in situ на нитроцеллюлозных фильтрах, используя в качестве зондов Р-меченные синтетические олигонуклеотиды или более длинные фрагменты после сшивки ДНКлигазой. Колонии переносят на фильтр проводят обработку фильтра для разрушения клеток 0,5 М NaOH в течение 5 мин, фильтрат нейтрализуют в растворе 0,2 М трис-HCt, рН 7,0, I М NaC, промьшают в 0,25 М фосфатном . буфере, рН 7,0, содержащем 0,3 М NaCl цитрат натрия, сушат при. в вакууме, а затем вьщерживают в течение 2-16 ч в гибрвдизационной смеси состава: 0,04% фикош 400; 0,04% бычий сывороточный альбумин; 0,04% поливинилпирролидон; 0,9 М NaCl, 0,09 М,цитра, натрия; 0,2% додеципсульфат натрия, Р-меченный зонд с радиоактивностью 10 имп/мин/мкл. Температуры гибридизации составляют: для олигонуклеотидов длиной 30 и более нуклёотиднЫх остатков 55-65°С, для олигонуклеотидов длиной 21-23 остатка - 45-50 С; для олигонуклеотида длиной 5 остатков - . Положение колоний, содержащих искомую последовательность ДНК, определяют радиоавтографией, используя пленку РТ-1.

Первичную последовательность фрагментов в составе гибридных моЛекул определяют методом Максама-Гилберта.

Для мечения 5 -концов используют полинуклеотидкиназу, как -описано, а для мечения 3 -концов проводят достройку с помощью ДНК-полимеразы.

Тестирование активности интерферона в клетках E.co2i проводят известным способом. 1 мл культуры E.coli (штамм 294 или ЗМН 7118, трансформированной гибридной плазмидой с искусственным геном, вырапщвают на LB-cpe де с 50 мкг/мл ампициллина до и разбавляют 25 мл среды М 9, содержащей 0,2% глюкозы, 0,5% казаминовых кислот, 50 мкг/мл ампициллина и 1 мМ изопропилтиогалактозид. Когда клетки достигают плотности А5 0,5 их осаждают центрифугированием, суспендируют в 1 мл 15% сахарозы, 50 мл трис-HCt, рН 8,0, 50 мМ ЭДТА. К суспензии клеток прибавляют 1 мг лизоцима и через 5 мин при ОС разрушают ; клетки ультразвуком. Центрифугируют 10 мин при 100 000 g. Активность ин-т терферона определяют в супернатанте, сравнивая с активностью стандартного лейкоцитарного интерферона (препарат ВНИИиЧБ, Ленинград, охарактеризованный относительно международного стандарта (В69/19) методом ингибирования цитопатического эффекта).

Полученные и литературные данные для сравнения приведены в таблице.

Как видно из таблицы, использование искусственного гена по сравнению с природным обеспечивает значительное .повышение экспрессии (числа молекул продукта на клетку E.coli), сравнимое с эффектом удвоения промотора. Этот вьшод является справедливым и для системы экспрессии с трипгтофановым промотором, использованном в прототипе. Очевидно, что экспрессия искусственного гена сзС 2 под контролем триптофанового промотора, использованного в прототипе, превышает уровень 9000 молекул на клетку. /

Внедрение в СССР микробиологического способа синтеза интерферона с использованием искусственного гёНа позволяет значительно- увеличить производство препарата для клинических и научных целей. Интерферон, получаемьш микробиологическим путем, не отличается по свойствам от природно го соединения и может быть получен в высокоочшценном состоянии.

Значительный практический интерес представляет использование искусственного гена интерферона С2 в других системах экспрессии в E.coli, а также создание продуцентов на основе промьш 0 ленных микроорганизмов.

Синтетический искусственный ген интерферона 2 не имеет природных аналогов. Он может быть использован в дальнейшем для создания продуцентов 5 новых неприродных интерферонов с измененной первичной структурой, обладающих другими свойствами.

1. Способ получения искусственного гена интерферонаоС2 человека,, зак лючающийся в. том, что из мононуклеотидов фосфотриэфирным методом синтезируют олцгонуклеотиды длиной 9-15 звеньев, полученные олигонуклеотиды фосфорилируют с помощью полинуклеотидкина-зы, олигомеры ной сшивкой фрагментов 1-4 по липким длиной от 28 до 99 пар оснований, далее их клонируют плазмид:5ами рВ8. 322, pBR 322 Mpt 3 и pUR 222, N-концевую половину гена собирают последователь- н сшивкой фрагментов 1.-4 по липким концам в составе векторной молекулы причем липкие концы сайтов Крп I и Ват HI удаляют ДНК-полимеразой I и S| -нуклеазой, а С-концевую половину гена собирают после клонирования одновременной сшивкой фрагментов 5-7 с определенной последовательностью нуклеотидов, затем две половины гена спшвают в полный искусственный геЯ интерферона оС 2 человека внутри- или межмолекулярным способом. 2. Способ получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом, включающим встройку искусственного гена интерферонасзС 2 челбвека в векторнз о плазмиду, нара ботку целевого продукта трансформированным микроорганиз ом н выдevП:eниe целевого .продукта, отличающ и и с я тем, что, с целью увеличения BbDcofta целевого продукта, при встройке искусственного, гена интерферона cL 2 человека используют лактозный оперон Е. coli в составе векторной, плазмиды а в качестве векторной плазмиды используют гибридную плазки .ду pLelF (plac) или pLelF-BI.

Предлагаемый pBR 322

(контроль)

ВМН Искусственный pLelF Plac Plac 7118 2

ВМН То же

pLelF-BI Ptet 7118

2,4 10

1,4 10 5 10 -10 310-610

1,4 10 5 10 -10

3100-6100 Plac

,13

Прототип

294 Природный 2 pLelF А25 Ptrp

Expression of the human fibroblast interferon in E.coli, T. Taniguchi et al. Proc. Nat. Acad Sci. USA, 1980, 77, n 9, 5230-5233. Synthesis of human fibroblast interferoti by E.coli. Q. Goeddel et al. Nucl. Acids Res. 1980, v. 8, n. 18, 4057-4074

J092176

14 Продсишеиие таблицы

9000

3,5 10 3,6 10

о. t а

«t к

н о

cd ff

о н

О о

к о

о о и

г и (Л о о

(N н 3

см

. о

U

Сч

I.

с о о

н

00

н

н

оо

о о н н

н (

о о

о н 3

о о о

ы.

W о

о ;О

ын

н

ын

н

ао

яР

J:

«

о о

in

о н

i/V CS1

Р о

о о

i

И . «sS Н

Г

о о

s

U о

(U

«

s

u

О

ff n) з:

I

§ I

а

«

Xi 5t

S

О Ql

Csi

к, ..I U Q t3 fc

Sill

-MC& З

t

«ll

rv3

M П

I

a-

KJ

(s

«s g

ll 11 III

i4

i-xi

I

S§

il s f

ll§

«5U

«Ч