Векторная плазмидная ДНК рТК 1285, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины, и способ ее конструирования Советский патент 1991 года по МПК C12N15/79 

%

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинатную плазмиду, обеспечивающую интеграцию чужеродного генетического материала в геном вируса осповакцины (ВОВ) штамма ЛИВП. Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического материала в составе вируса осповакцины штамма ЛИВИ. Новая плазмидная ДНК рТК 1285 состоит из фрагментов генома ВОВ штамма ЛИВП, расположенных на расстоянии 142-736 н.п. и 769-1379 н.п.от HindIII-сайта рестрикции К-фрагме нта генома ВОВ, полилинкера длиной 80 н.п.. содержащего уникальные сайты рестрикции Clal, Hindlll, Xbal, Sal GI, Вал-HI, PvuII и Eco RI, векторной части, имеющей последовательности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2068-4357 н.п., плазмиды pBR 322. Полученная генно-инженерная плазмида характеризуется способностью интегрировать в геном ВОВ чужеродный генетический материал, например ген VP1 вируса гепатита А штамма HAS 15 с поздним промотором ВОВ Р, . 2 с.п. ф-лы. § (Л

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии, а именно к получению рекомбинантов вируса осповакцины (ВОВ).

Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического материала в составе ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП.

Сконструирована рекомбинантная плазмида рТК 1285,содержащая векторную часть, а также нуклеотидную последовательность. ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП с полилинкером внутри него.

Основное требование к выбору полилинкера - наличие уникальных участ- ков узнавания рестриктаз типа II. Причем участки гидролиза рестршстаз, t содержащиеся в составе полилинкерной области, удаляют из векторной.части и вирусспецифической последовательНОСТИф

Сконструированная плазмидная ДНК рТК 1285 размером 3598 н.п. состоит из:

f векторной части в виде Clal-PvuII-1 Фрагмента ДНК плазмиды pBR 322 Д длиной

С& Ј

3 , 16

2313 н.п,, которая является производной плазмиды pBR 322 и не содержит, участка узнавания рестриктазы Eco RI (делеция нуклеотидной последовательности AAGAATT, полученная в результа4358 2

те последовательной обработки ДНК pBR 322 ферментами ЕсоКГи S где цифрами отмечены положения крайних нуклео тидов, а также кодируют ген устойчиво сти к ампициллину в качестве генетического маркера;

фрагмента генома ВОВ штамма ЛИВП, содержащего последовательность ТК-ге- на от 142 до 1379 н., имеющего только два сайта рестрикции (Clal и Eco RI),и отличающегося в трех положе- ниях (328 н. , 970 н. , 1010 н. ) от первичной структуры HindIII-I - фрагмента генома ВОВ штамма WR с полилинкером плазмиды pUR 278, содержащим участки узнавания рестриктаз Clal, HindiII, Xbal, Sal GI, Bam HI, PvuII и Eco RI.

Способ конструирования рекомбинан- тной плазмидной ДНК рТК 1285 включает в себя:

гидролиз S| - нуклеазой Eco RI линеаризованной плазмиды pBR 322 с целья удаления Есо RI-сайта рестрикции в векторно й части;

клонирование Hindlll - К- и Hindlll - PvuII-фрагментов ДНК ВОВ штамма ЛИВП;

гидролиз S - нуклеазой Hindlll- Xbal-линеаризованной плазмиды рТК 1708 с целью удаления участков расщепления рестриктаз Clal, Hindlll и Xbal в векторной и вирусспецифичес- кой частях;

игирование Clal-RuII- и С1аГ Bspl-фрагментов ДНК плазмиды рТК 1567 с целью удаления PvuII-сайта рестрикции;

клонирование Clal-Eco RI-полилин- кера плазмиды pUR 278 в плазмиде рТК 1238.

Предлагаемый способ конструирования существенно отличается от извест- ных тем, что с помощью обработки ДНК S.-нуклеазой удаляют природные сайты рестрикции Eco RI, Hindlll, Xbal и PvuII и получают последовательность ДНК с метилированным аде- нином в участке узнавания Clal (27 н.) для штаммов E.coli dam -фенотипа, что позволяет ввести полилин644

кер с уникальными сайтами расщеплени рестриктаз, узнающих гексаиуклеотид- ные последовательности ДНК, внутрь ТК-ге на.

Сущность изобретения заключается в том, что для интеграции чужеродного генетического материала в геном ВОВ- конструируют плаэмидный вектор, содержащий ТК-ген и прилегающие районы HindIII-К-фрагмента ДНК ВОВ штамма ЛЖИ, отличающийся тремя нуклео тидами от первичной структуры Hindlll - I-фрагмента генома ВОВ штамма WR и имеющий только два сайта крупнощепящих рестриктаз в вирусспе- цифической последовательности ДНК, по которым клонируют полилинкер. Искусственно введенные 7 уникальных сайтов рестрикции используют для кло- .нирования чужеродных генов, которые методом контрансфекции интегрируют в ДНК ВОВ.

Приме р 1 .Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pBR 322 &

5 мкг плазмидной ДНК pBR 322 расщепляют эндонуклеазой рестрикции Eco RI (5е„а„) в 10 мМ трис-НС1, рК 7,5; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1 мМ NaCl; 10 мМ MgCla при 37°С 60 мин, как описано. Проводят осаждение ДНК этанолом и обрабатывают нуклеазой S (1 е.а.) в 0,2 мМ NaCl; 50 мМ ацетата Na (pH 4,5); 1 мМ 0,5%-ного глицерина при 37°С и 30 мин. Реакцию останавливают добавлением до 50 мМ ЭДТА. После осаждения препарата ДНК спиртом проводят лигированяе. Реакционная смесь содержит 5 мкг ДИК; 30 е.а. ДНК-лигазы фага Т4; 50 мМ трис-HCl, рН 7,5; 0,5 мМ А1Р; 10 мМ 2-меркаптоэтанола; 5 мМ MgCl. Инкубация проходит от J до 18 ч при .8° С о После тепловой денатурации белков добавляют до 0,1 мМ NaCl и 5 е.а. фермента Eco RI и выдерживают 60 мин п.ри 37°С. ДНК осаждают спиртом. Далее проводят трансформацию компетентных клеток штамма E.coli НВ101 и анализ на наличие в плазмидах1 ДНК сайта рестрикции Eco RI. Одна из колоний, содержащая устойчивую к эн«- донуклеазе рестрикции Eco RI плазмид- ную flHK(pBR 322 Д, наращивается в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) и тетрациклином (20 мкг/мл). Плазмид- ную ДНК выделяют щелочным методом и секвенируют методом Максама-Гилберта от Clal-сайта рестрикции.

516401

Пример2. Клонирование Hindlll - К-фрагмента генома ВОВ штамма ЛИВП.

ВОВ штамма ЛИВП растят на культуре клеток ВНК-21 и выделяют по известному методу. Полученный препарат вируса разбавляют четырьмя объемами IE-буфера и осаждают вирус центрифугированием (40 000 g, 30 мин, 0°С). 10 Осадок ресуспендируют в ТЕ-буфере до концентрации 10 вирусных частиц на

1мл и проводят депротеинизацию в 0,1 мМ ЭДТА; 0,5%-ной N-лаурилсарко- зината Na; 100 мкг/мл протеиназы К .с при 4°С 3 ч. Затем повышают концентрацию детергента до 4% и инкубируют

2ч при 50°С. Полученный лизат центрифугируют (250 000 g, 15 ч, 18°С) в ступенчатом градиенте концентраций 20 CSC1, приготовленном из равных объемов растворов СаС в 1 х SSC, имеющих плотность 1,8 и 1,7 г/см3. Зону ДНК извлекают и диализуют против ТЕ- буфера.25

200 мкг вирусной ДНК расщепляют эндонуклеазой рестрикции HindIII (5 е.а.) в 10 мМ трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ 2-меркаптоэтанола; 50 мМ Nad; 10 мМ MgCl при 37°С 60 мин. Электре- 30 элюцией выделяют Hindlll - К фрагмент ДНК из 0,8%-ного агарозного геля и лигируют с HindIII-линеаризованной плазмидой pBR 322 Д. После трансформации лигазной смесью компетентных клеток штамма E.coli HB 101 проводят отбор колоний фенотипа и рест- рикционный анализ плазмидных ДНК (pBRHK).

П р и м е р 3. Рекомбинантные плазмидные ДНК рТК 1708, рТК 1567, рТК 1238 и РТК 1285.

Плазмидную ДНК pBRHK подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции PvuII в стандартных условиях и сшивают ДНК-лигазой фага Т4 по примеру 1. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coli HB 101 и отбирают колонии, содержащие реком- бинантные плазмиды с Hindlll - PvuII- „ фрагментом ДНК длиной 1708 н.п. (рТК 1708).

Плазмидную ДНК рТК 1708 расщепляют последовательно рестриктазами Hindlll и Xbal, выделяют больший фрагмент ДНК, который инкубируют с нуклеаэой S по примеру 1. Затем препарат ДНК сшивают ДНК-лигазой фага Т4 и проводят трансформацию комле-40

45

55

10

.с

2025

30

„

0

45

5

646

тентных клеток штамма E.coli HB 101. Колонии, содержащие плазмидные ДНК, устойчивы к эндонуклеазам рестрикции Hindlll и Xbal, имеют одну точку разрыва для рестриктазы Clal и нарабатывают в среде LB. Плазмидные ДНК выделяют щелочным методом и сек- венируют район соединения векторной части и вирусспецифической последовательности ДНК. Плаэмидную ДНК, которую называют рТК 1567, нарабатывают в препаративном количестве и используют на следующем этапе.

Плазмидную ДНК рТК 1567 расщепляют совместно рестриктазами Clal и PvuII. Выделяют больший фрагмент ДНК и сшивают с ClaI-BspI-фрагментом ДНК длиной 634 н.п. плазмиды рТК 1567. Лигазной смесью транспортируют компетентные клетки штамма E.coli HB 101 и отбирают колонии, содержащие плазмиды, устойчивые к гидролизу рестрик- тазы. PvuII (рТК 1238), а вирусспеци- фическую нуклеотидную последовательность ДНК определяют методом Максама - Гилберта и проводят сравнительный анализ с первичной структурой HindIII- I-фрагмента генома ВОВ штамма WR.

Описанное последовательное конструирование плазмиды ДНК позволяет получить рекомбинантную ДНК, не содержащую сайты рестрикции ферментов Hindlll, Xbal и PvuII. Наличие двух уникальных участков рестрикции в плазмидной ДНК, выделенной из штамма dam -фенотипа, эндонуклеаз Clal и Eco RI позволяет ввести в ТК-ген полилинкер.

Плазмидную ДНК pUR 278 расщепляют ферментами рестрикции Clal и Eco RI в стандартных условиях, выделяют Clal-Eco RI-фрагмент ДНК длиной 80 н.п. и клонируют в плазмиде рТК 1238 по Clal и Есо RI-сайтам. Целевую рекомбинантную плазмидную ДНК рТК 1285 отбирают методом ДНК-ДНК-гибридизации и подвергают рестрикционному анализу эндонуклеазами рестрикции, имеющими участки узнавания в полилинкере.

П р и м е р 4. Получение рекомби- нантного ВОВ, содержащего ген VP1 вируса гепатита А штамма HAS 15.

Плазмидную ДНК pHAV 23 расщепляют рестриктазами Hindi и Bam HI в стандартных условиях и выделяют фрагмент ДНК длиной 141 н.п., содержащий N- концевую часть гена VP1BTA, из 4%-ного ПМГ после электрофореза. Hindll- 8am НГ-фрагмент ДНК сшивают с синте тическими олигоиуклеотидами II и III и Pstl-Bam HI-линеаризованной плаз- мидрй pUC 18 с помощью ДНК лигазы фаза Т4, Лигазной смесью тиансформируют компетентные клетки штамма E.coli IM 103. Колонии фенотипа lacZ вырабатывают на среде LB. Выделяют плазмидную ДНК, чувствительную к рестриктазам PstI и Bam Hl(pUC 18- NVPI-HAV), и секвенируют от Hindlll- сайта методом Максама-Гилберта.

Плазмидную ДИК pUC 18-NVP1-HAV расщепляют эндонуклеазами рестрикции PstI и Bam HI и выделяют меньший фрагмент ДНК длиной 155 н.п. Параллельно проводят гидролиз рестрикта-/ зами Clal и Eco RI плазмиды pWF3 и выделение Clal-Eco RI-фрагмента ДНК протяженностью 546 н.п., содержащего поздний промотор Р« ВОВ. Фрагменты ДНК длиной 155 и 546 н.п. и синтетический олигонуклеотид I лигируют с Clal-Bam HI-векторной частью плазмиды рТК 1285. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.Coii HB 101 и отбирают колонии ДНК- ДНК-гибридизацией Рекомбинантные молекулы ДНК (рТК 1285 - P.-NVPI-HAV) анализируют рестриктазами Clal, Eco RI, PstI и Bam HI.

Плазмидную ДНК pHAV 23 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции Bajn HI и Pvull. €-концевую часть гена VP1 В ГА длиной 671 н.п выделяют из 4%-но- го ПААГ и сшивают с Ват HI-PvuII-ли- неаризованвой плазмидой рТК 1285- PM-NVP1 HAV. Пягазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coli HB 101. Отбирают колонии ДНК- ДНК- гибридизацией и плазмядные ДНК (рТК 1285-Рн-УР1 НАУ)подвергают ре- сгрикцнонному анализу. В сконструированной шшзмидвой ДНК определяют первичную структуру состыкованных участков методом Максама-Гчлберта.

ДНК плазмиды рТК VPt-HAV используют для трансформации клеток почки зеленой мартышки CV-I, зараженных БОВ штамма ЛИВП. Урожай вируса после трансформации высевают на монослой перевиваемой линии клеток К143. В присутствии 25 мкг/мп бром- дезоксиуридина отбирают вирусные ТК- клоны. Методом ДНК-ДНК-гибридизации проверяют наличие гена VB1 ВГА в клонах. Вирусную ДНК клона 809 выделяют

0

5

0

5

0

5

по примеру 2 и подвергают анализу рестриктазой Hindlll.

Таким образом, сконструирована новая рекомбинактная плазмидная ДНК рТК 1285s имеющая расширенный состав уникальных сайтов рестрикции внутри ТК-гена BOB (Clal, HindIII, Xbal, Sal-GI, Bam HI, Pvull и Eco RI), что существенно расширяет выбор стратегии клонирования чужеродных генов. Определена нуклеотидная последовательность ТК-гена и прилегающих районов генома ВОВ штамма ЛИВП, необходимая для рекомбинации с вируо ой ДНК. Показаны отличия первичной структуры ТК-генов между птаммами ЛИВП и WR. На примере гена VP1 вируса гепатита А продемонстрирована возможность использования плазмиды рТК 1285 для получения вирусных рекомби™ натов.

Формула изобретения

фрагменты ДНК pBR 322, имеющие по- следонатепъности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2068-4357 н.п, с геном устойчивости к ампициллину;

фрагменты ДНК осповакцины, расположенные на расстоянии 142-736 н.п, и 769-1379 н.п. от Hifidlll сайта рестрикции К-фрагмента генома ВОВ штамма ЛИВП, кодирующие N™ и С-концевые части ТК-гена соответственно;

Clal-Eco RI - полилинкерный фрагмент ДНК плазмиды pUR 278 длиной 80 н.п., с участками узнавания реет- риктаз Clal, HindIIIs Xbal, S.al GI, Bam HI, Pvull и Eco RIj

уникальные сайты рестрикции: Clal, Hindlll, Xbals Sal G Bam HI5 Pvull и Eco RI|

0

5

. устойгенетические маркеры, amp чивость к ампициллину}

емкость от 100 до 1,4 тыс. н.п.;

штаммы-хозяева: штаммы E.coli dam -фенотипа.

чают векторную тшазмндную ДНК pBRплазмиде рТК 1567 делетируют Bspl322&,в которую по HindIII-сайту кло-PvuII-фрагмент ДНК длиной 328 н.п.,

нируют ТК-ген вируса осповакцинысодержащий С-концевую часть вирусспештамма ЛИВП в составе HindIII-K-фраг-цифической последовательности ДНК,

мента вирусного генома, в полученнойс помощью лигирования линеаризованплазмиде pBRHK делетируют PyuII-ной ClaI-PvuII-плазмидной ДНК с

фрагмент, содержащий часть JiindIII-К-Сlal-Bspi-фрагментом вирусной ДНК

фрагмента ДНК вируса осповакцины иразмером 643 н.п., по Eco RI-ClaI

часть ДНК плазмиды pBR 322 Д , содер- псайтам полученной промежуточной плаз жащий структурную часть гена устой-миды рТК 1238 встраивают Eco RI-ClaI чивости к тетрациклину, после чего изполилинкер ДНК pUR 278, и получают

полученной плазмиды рТК 1708 с помо-целевую рекомбинантную плазмидную

щью. нуклеазы S удаляют Hindlll- иДНК рТК 1285. Xbal-сайты рестрикции, в полученной