Вектор рМВ 124 для получения фрагментов ДНК с произвольными липкими концами и способ его конструирования Советский патент 1988 года по МПК C12N15/00 

4 4 О)

05

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантньпс ДНК методами генетической инженерии и может найти применение в биотехнологии при создании штаммов-продуцентов целевых продуктов.

Цель изобретения - создание вектора, позволяющего получать клонируемые в нем фрагменты ДНК с произвольными шпкими концами.

Поставленная цель достигается конструированием плазмиды рМВ 124, состоящей из EcoRI-PstI фрагмента ДНК плазмиды pUR 222 и полилинкера:

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии и представляет собой векторную дак РВМ 124 для получения фрагментов ДНК с произвольными липкими концами. Полученная рекомбинантйая ДНК имеет молекулярную массу 1,8 МД и содержит Е со R I-Pst 1 фрагмент ДНК плазми/ ды pUR 222 с геном /3-лактамазы и частью модифицированного гена f, -га- лактозидазы E.coli, а также синтетический полилинкер длиной 42 н.о. Полилинкер включает между попарными сайтами Fok I и Hga I набор сайтов для эндонуклеаз рестрикции Sal 16, Асе I, Hind II, Bam Н I противоположной полярности. Целевые фрагменты ДНК получают путем клонирования субфрагментов в составе сконструированной векторной плазмиды рМВ 124 по сайтам Fok I и Hga 1 с последующим их выщеп- лением рестриктаз Fok I и Hga. 2 с.п. ф-лы.

GGATGACGCGTCGACAAGCTAGCTTGGATCCGCGTCATCCAG ACGTCCTACTGCGCAGCTGTTCGATCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTA,

Целевую плазмиду получают путем расщепления ДНК плазг тды pNIMB эндо- нуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI, лйгирования полученного гидролизата с синтетическиг и олигонуклеотидами GATCCGCGTCATCCAG и AATTCTGGATGACGGG с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4 в случае получения рМВ 123. Полученной смесью трансформируют клетки Е, coli ВМН 7118 и проводят отбор клонов, ух:тойчивых к ампициллину, с фе- нотипом Lac (промежуточная плазми- да рМВ 121). Из индивидуальных клоно выделяют ДНК плазмиды рМВ 121, которую расщепляют эндонуклеаэами рестрикции PstI и SalGI и лигируют с олинонуклеотидами GGATGACGCG и TCGAGGCGTGATCCTGCA. Полученной лигаз ной смесью трансформируют клетки Е. ,coli и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фенотипом Lac (промежуточная плазмида рМВ 123). Расщепляют ДНК плазмиды рМВ 123 эн- донуклеазой рестрикции Hind HI, достраивают липкие концы с помощью ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) и лигируют полученный дуплекс. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фенотипом Lac (плазмида рМВ 124).

Пример 1. Химический синтез олигонуклеотидов

GGATGACGCG TCGACGGGTGATCGTGGA GATCCGCGTCATCCAG AATTCTGGATGACGCG

проводят твердофазным фосфотриэфир- ным методом. В качестве носителя используют модифицированный силохром.

5

0

0

5

5

0

5

0

5

Наращивание олигонуклеотидной цепи проводят от З - к 5 - концу с помощью динуклеозиддифосфатных производных (МеО)2Тг Np(PhCl) NP(PhCl). Выделение целевого продукта после деблокирования реакционной смеси проводят путем последовательных хроматографии на Lichrosorb RP 18 сначала в 0,1 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила 15-40%, Затем раствор вьщеленного тритилолигонукле- отида упаривают досуха, растворяют в 2,5 мл 80%-ной водной уксусной кислоте И- вьщерживают при комнатной температуре 45 мин. Раствор упаривают досуха, растворяют остаток в 1 мл дистиллированной воды к хроматографиру- ют на Lichrosorb PR 18 в 0,05 М триэтиламмонийацетате в градиенте а це- тонитрила 5-20%.

Конструирование целевой реком- бинантной ДНК рМВ 124 состоит из двух этапов. На первом этапе кон- стрзшруют промежуточные плазмидные ДНК рМВ 122 и рМВ 123.

5 мкг ДНК плазмиды pNIMB гидроли- зуют совместно эндонуклеазами рестрикции рагаН и EcoRI в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 (20мМ трис-HCl, рН 7,8, 10 мМ MgCl-i, 10 мМ 2-меркаптоэтанол) и 100 мМ NaCl при 37 С 1 ч. Реакционную смесь после добавления 5 мкл 0,4 М ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и изоамилового спирта. Затем к реакционной смеси добавляют NaAc до концентрации 0,3 М, рН 7,0 и осаждают ДНК двумя объемами этанола. Полученный препарат ДНК вектора pNIMB растворяют в 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ. трис-HCl, рН 7,8; 1 мМ ЭДТА).

К 5 мкл раствора вектора pNIMB добавляют по 20 пкмоль олигонуклеотидов (III и IV), 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в 30 мкл буфера 2 (20 мМ

трис-НС1,.рИ 6, 10 мМ MgCl 2, ШмМ 2 меркаптоэтанол и 0,5 мМ АТР).

Реакционную смесь выдерживают 12 ч при , затем.используют для трансформации клеток E.coli ВМИ 7118 Суспензию клеток после трансформации высевают на 1,5% LB агар, содержащий 75 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл . Чашки инкубируют 12 ч при 37 С Из колоний, имеющих Lac фенотип, щелочным методом выделяют ДНК плаз- миды рМВ 121. Bspi и Fokl гидроли- заты полученной ДНК анализируют в 4% ПААГ. Клон, имеющий дополнительньш Fok 1-сайт в штазмидной ДНК, выращивают в 100 мл среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 16 ч при З7 с на качалке (200 об/мин). Клетки собирают центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин, 4°С), плазмид- ную ДНК рМВ 121 вьщеляют щелочным методом с последующей дополнительной очисткой в градиенте плотности CsCl.

5 мкг ДНК плазмиды рМВ расщепляют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции PstI в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 и 50 мМ NaCl, 1 ч при 37°С. Затем к реакционной смеси добавляют NaCl до концентрации 150 мМ, 2-меркапто- этанол до 20 мМ и 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Sal GI, вьщерживают

1ч при 37°С. Реакционную смесь после добавления 6 мкл М ЭДТА, рН

8,0 экстрагируют равным объемом вод- ного фенола и изоамилового спирта. ДНК вектора рМВ 121 осаждают этанолом и растворяют в 50 мл ТЕ-буфера.

5 мкл раствора вектора рМВ 121 отбирают для получения плазмиды рМВ 123. К реакционной смеси добавляют по 20 пкмоль олигонуклеотидов I и II,

2ед. ДНК-лигазы фага Т4 в 30 мкл буфера 2 и выдерживают 12 ч при 10°С. Полученной лигазной смесью трансфер-

5 CCGTCGACAAGAATCCCAAACTCACCAGAAT; (V) 5 ATGAAAAACTTAAATGTGAGCATTCTGGTGA; (VI) 5 GCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCA; (VII)

5 CCCAGATCTCTAAACACTGAAGATGTTTCA.

Из полинуклеотидов (I-VII1) получают дуплексы клонирования.

Реакционную смесь, содержащую по 100 пмоль меченного поли- нуклеотида (V) и фосфорнлированного

мирутот клетки Fl.coli ВМН 7118. Из ко лоний (получение см.вьппе), имеющих Lac фенотип, выделяют плазмидную ДНК. После рестрикционного анализа с помощью Bspl и Fokl эндонуклеаз определяют ее первичную структуру в районе встроенного полилинкера по методу Максама-Гилберта.

5 мкг ДНК плазмиды рМБ 123 гидро- лизуют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Hindlll в 50 мкл буфера 1, содержащего 50 мМ NaCl, 1 ч при 37°С. Затем в реакционную смесь добавляют dNTP., до концентрации 100 мкМ и до общего объема 100 мкл, прибавляют 1 ед. ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова) и вьщерживают 30 мин при 20°С. Реакционную смесь разбавляют 5 мкл 0,4 М ЭДТА (рН 8, 0) и экстрагируют водным фенолом и изоамиловьм спиртом. ДНК осаждают двумя объемами этанола. 0,5 мкг полученной ДНК обрабатывают 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в 30 мкл буфера 2 в течение 16ч при 10°С. Реакционную смесь используют для трансформации клеток E.coli ВМН 7118. Суспензию клеток после трансформации высевают на 1,5% агар, содержащий 45 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл X-Gal. Из колоний, имеющих Lac фенотип, выделяют плазмидную ДНК щелоч- Hbw методом. Bspl и Bspl + Hind III- гидролизаты полученной ДНК анализируют в 4% ПААГ. Первичную структуру в районе встроенного полилинкера определяют по методу Максама-Гилберта.

П р и м е р 2. Получение субфрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствующую 32-60 аминокислотам человеческого ин- терлейкина-2, с произвольно запланированными липкими концами.

Описанным способом синтезируют и вьщеляют следующие нуклеотиды:

(VIII)

55

холодньм АТР полинуклеотида (VI) в 100 мкл буфера 3 (60 мМ трис-НС1, рН 7,5; 10 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркап- тоэтанол) нагревают 10 мин при 50 С, охлаждают до , добавляют до

5 144Ы60

концеитрацнн 250 мкМ и 10 ед. ДНК-(условия см. ньшш) обрабатывают 2 ед. полимеразы I (фрагмент Кленова). Ре-ДНК-лигазы в описанных условиях. Ли- акционную смесь инкубируют 30 минга зной смесью трансформируют клетки при 20 - С, добавляют Ю мкл 0,4 М K.coli ВМН 7118 (или JM 103). Из ко- ЭДТА (рН 8,0), экстрагируют воднымлоний, имеющих LacZ. фенотип, гиб- фенолом. ДНК-дуплекс осаждают ацето-ридизирующихся с Р -мечеными зонном, содержащим 2% ТЛСЮ, промываютдани, вьщеляют ДНК и дополнительно спиртом, сушат на воздухе, осадоканализируют с помощью Bspl, EcoRI и растворяют в воде. Полученный дуп-10 PstI гидролиза.

леке расщепляют 500 ед. эндонуклеа-Бактерии E.coli ВМН, содержащие

зы рестрикции SalG в 200 мкл буфераплазмиды plL 58 со вставкой требуе2, содержащего 150 мМ NaCl, в теме-мого размера, выращивают в 100 мл LB

ние 12 ч при . Аналогично полу-среды. Для получения .целевого субчают дуплекс из полинуклеотидов (VII15 Фрагмента, кодирующего часть гена

и VIII), который расщепляют обработ-человеческого интерлейкина-2 с заракой 200 ед. эндонуклеазы рестрикциинее запланированными липкими конBgl II в 200 мкл буфера 2, содержа-цами, 15 мкг ДНК плазмиды pIL 58 в

щего 50 мМ NaCl, в течение 12 ч при15 мкл буфера 1, содержащего 50 мМ

. Оба рестрикта вьщеляют с помо-20 NaCl, обрабатывают 20 ед. эндокуклещью гель-электрофореза в 8% ПААГ. азы рестрикции Fokl или Hgal 1 ч при

Реакционн- то смесь, Содержащую по37 С. Целевой фрагмент длиной 83 нук2 пмоль приготовленных дуплексов илеотидных пар вьщеляют с помощью

0,25 пмоль векторной ДНК, полученнойэлектрофореза в 6% ПААГ. Структуру

из рМВ 124 совместным расщеплением25 полученного фрагмента подтверждают

эндонуклеазами рестрикции .BamHIметодом Максама-Гилберта.

(50 мкл раствора, содержащего буферОписанным способом синтезируют 1 и 100 мМ NaCl при 37 С 1 ч) и SalGI полинуклеотиды

5 CCGAGATCTAGAAGAAGAACTCAAAGTCCTGGAAGAAGTG; (IX) 5 GAAAATTTTTGCTTTGTGCTAAATTCAGCACTTCTTCCAG; (Х)

5 ACTTACGTCCCCGTGACTTAATCTCCAATATCAACGTAAT; (XI)

SalGI 5 CCTGTCGACCCTTCAGTTCCAGTACAATTACGTTGATA. (XII)

40

Аналогично примеру 1 из полинукле-ют с помощью Bspl и EcoRI + PstI гидотидов (IX) и (X), (XI) и (XII) полу-ролиза. ,

чают дуплексы, которые затем расщеп- Колонии, имеющие плазмиды pIL 912 ляют эндонуклеазами рестрикции Bglllсо -вставкой требуемого размера, выра- и SalGI соответственно. Реакционную 45Щивают в 100 мл LB среды. Для получе- смесь, содержащую по 2 пмоль приго- ния целевого субфрагмента, кодирую- товленных дуплексов и 0,25 пмоль век-щего часть гена человеческого IL-2 торной ДНК, полученной из рМВ 123с произвольными липкими концами, совместным расщеплением эндонуклеаза-15 мкг ДНК плазмиды pIL-912 в 150 мкл ми рестрикции BamHI и SalGI (условия 50буфера. 1, содержащего 50 мМ NaCl, об- см. вьше), обрабатывают 2 ед. ДНК-ли-рабатываю.т 20 ед. эндонуклеазы ре- газы в описанных условиях. Полученнойстрикции FoRI или Hga 1 ч при 37 С. лигазной смесью трансформируют клетки Целевой фрагмент длиной 114 нукле- E.coli ВМН 7118. ДНК, вьщеленные изотидных пар вьщеляют с помощью элек- колоний, имеющих Lac ф.енотип, гиб- ggтрофореза в 6% ПААГ.

ридизуют с - Р-мечеными зондами. Таким образом, предлагаемый способ

полученными из полинуклеотидов (IXполучения субф рагментов ЛНК с произи XII). ДНК, гибридизирующиеся с обо-вольными липкими концами, основаними зондами, дополнительно анализиру-ный на применении плазмидньгх рМВ 124,

имеет существенные преимущества. Прежде всего, конструкция плазмидной ДНК рМВ 124, содержащей между попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции Fokl и Hgal противоположной ориентации, набор сайтов для рестриктаз SalGI, AccI, Hindu, Hind III, BamHI дает возможность в отличие от известного клонировать фрагмент из нескольких субфрагментов и, таким образом, получать протяженные химически синтезированные ДНК фрагменты.,В примере 2 фрагменты клонированы из двух субфрагментов, что позволяет в несколько раз уменьшить объем биохимической и генно-инженерной работы при получении целевой последовательности ДНК. Несомненным преимуществом является использование при получении произволь- ных липких концов целевых фрагментов ДНК коммерчески доступных эндонуклеаз рестрикции Fokl и Hgal.

В некоторых случаях возможно ограничиться использованием только одной рестриктазы Fokl, что значительно удешевляет способ получения фрагментов ДНК.

Благодаря наличию сайтов узнавания для эндонуклеаз рестрикции Fokl и

GGATG AGCGCTCGACAAGCTAGCTTGGATCCGCGTCATCCAC ACGGGTACTGCGCAGCTGTTGGATCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTAA,

С попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции Fokl и Hgal противоположной полярности сайты для эндонуклеаз рестрикции SalGI, AccI, Hindll и BamHI )

фрагменты размером 11 80, 100, 174, 260 область полилинкера, 267, 290, 434, 457, 587 п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазной рестрикции ВзрЬ;

фрагменты размером 26, 34, 67, 110, 147, 200, 242, 404, 424 область полилинкера, 489, 500, п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазной рестрикции Mspl;

фрагменты размером 8, 88, 181, 244, 287, 614, 1254 п.о., образую

Hgal в полилинкере и при использовании для клонирования сайтов для рестриктаз SalGI, AccI, Hind II и BamHI появляется возможность получать уникальные липкие концы, определяемые структурой самого произвольно выбранного фрагмента ДНК, клонируемого по указанным сайтам. Это может позволить использовать такие фрагменты в генетической инженерии для одновременной . и направленной сборки нескольких фрагментов ДНК в системе in vitro, Кроме того, уникальные липкие концы фрагментов могут позволить их раздельное мечение при помощи Р, что необходимо для определения первичных структур ДНК и для ряда других биохимических задач.

Формула изобретения

щиеся после расщепления эндонуклеаз- ной рестрикции Fokl;

вставку субфрагмента для клонирования по SalGI и BamHI-сайтам поли- линкерной области;

емкость не менее 622 п.о.;

штаммы-хозяева: штаммы E.coli с

LacZ Ml5 фенотипом.

и циклизуют ДНК-лигазой фага Т4.