Способ конструирования вектора pVM061 Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 

1

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и касается конструирования плазмидного вектора для выражения экзогенных генов в трансформированных штаммах бактерий E.coli,

Целью изобретения является получение авторегулируемого стимулируемого вектора.

Функциональные элементы данного вектора состоят из липопротеинового ген E.coli, фрагмента стимулируемого промотора-1 ас-промотора E.coli, фрагмента ДНК для репрессора, который содержит целый функциональный ген 1 ас E.coli, а целевой полипептид выражается в трансформантах E.coli.

Пример 1. 2 мкг ДНК плазмиды р S C101 переваривают до конца двумя единицами ограничительной эндонуклеазы Eco RI в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 100 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5) 75 ммоль/л NaCl, 6 ммоль MgCl-, 6 ммоль/л й-меркаптоэтанола и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) буфером Eco RI при 37°С в течение 60 мин. Чтобы предотвратить

самолегирование ДНК р S C101, обработанной Eco RI, добавляют бактериальную щелочную фосфатазу (ВАР) (0,1 ед. Worthing to BAPF) и инкубирование продолжают в течение 60 мин при 37 С. Реакцию заканчивают фенольной экстракцией, и линиаризованные ДНК выде-. ляют этанольным осаждением.

Ј 1

СО О О 4

см

314

Фрагмент ДНК длиной 2,8 тыс. оснований, содержащий липопротеиновый ген E.coli, получают отдельно из гибридного -фага, несущего лилопротеи- новый ген E.coli (обозначенный как 1рр ) . Липопротеиновый ген предварительно клонируют в 7 -фаговый вектор 540 следующим образом: всю ДНК (200 мкг), выделенную из штамма К-12 E.coli, меродипдоидного для ли попротеинового гена (Те 5519/F 506) переваривают с 200 ед. ограничительного фермента Hind III. Фрагменты ДНК разделяют на препаративном ага- розном геле и собирают фракции фрагментов ДНК длиной примерно 10 тыс. оснований, которые проявляют положительную гибридизацию с 5 -32р-липо- протеиновой и-РНК, при использовании южного способа гибридизации. Смесь фрагментов Hind III длиной 10 тыс. оснований (обогащенную примерно в двадцать раз) и расщепленной Hind I Л 540 векторной ДНК контактируют с Т4 ДНК-лигазой. Легированную ДНК используют для трансфекции E.coli К302 NRRI В-15016. Рекомбинантные фаги, несущие липопротеиновый ген, отбира

ют с помощью зонного способа гибриди- зации, при,использовании 5 -32р-липо- протеиновой и-РНК. Было найдено, что одна из исследованных зон, дающая положительную гибридизацию, несет полный функциональный липопротеиновый ген, и ее обозначили .

Двести микрограммов ДНК 1рр Ее-1 полностью переваривают с 200 ед. ограничительного фермента Нае III в 500 мкл реакционной смеси, содержащей 6 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5), 6 ммоль/л MgCl,, ммоль/л NaCl, 6 ммоль/л jb-меркаптоэтанола и 100 мкг/мл. бычьего сывороточного альбумина (буфером Нае III).при 37 С в течение 2 ч, и фрагмент Нае II длиной 2,8 тыс. оснований, несущий липопротеиновый ген E.coli, очищают фракционированием на 5%-ном полиак- риламидном геле по следующей методике. Сначала реакционную смесь экстрагируют фенолом, а затем фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, сушат под вакуумом, растворяют в 200 мкл буфера, содержащего 5% глицерина, 20 ммоль/л ЭДТА, 0,5% бромо- фенола голубого и 0,05% ксилолци а- нола (эту смесь называют гелевым бу

0

$

5

0

Q

5

0

5

0

5

фером) и после этого фракционируют на 5%-ном полиакрп-ппмидном геле. Но- лоску ДНК, которая мигрировала в положение 2,8 тыс. оснований, вырезают из геля и фрагменты ДНК элюируют из геля электрофорезом. Краситель бромистый этидий, используемый для локализации полосы ДНК в геле, удаляют из фрагментов ДНК фенольной экстракцией, Фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, центрифугируют, растворяют в 200 мкл 0,3 м/л ацетата натрия, повторно осаждают 0,5 мл этанола и снова сушат под вакуумом. Выделяют примерно 10 мкг очищенного фрагмента Нае III длиной 2,8 тыс. оснований.

Для того, чтобы клонировать фрагмент Нае 111 длиной 2,8 тыс. оснований в pS CI01, синтетические молекулы Eco R1 связки присоединяют к концам фрагмента Нае 111 длиной 2,8 тыс., оснований. Связку Eco RI (5 ГГААТТЦЦ3 фосфорилируют Т4 полинуклеотидной киназой вместе с АТФ в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 3 моль связки, 66 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5), 10 ммоль/л MgCl2 , 10 ммоль/л /J-мер- каптоэтанола, 60 мкмоль/л ЛТФ и 10 ед. 74 полинуклеотидной киназы. После инкубирования смеси при 37 С в течение 30 мин, ее нагревают при 60°С в течение 10 мин и охлаждают до 37°С. Пять мкл 0,1 моль/л -меркап- тоэтанола и 10 ед. Т4 полинуклеотидной киназы добавляют к смеси и реакцию продолжают при 37 С в течение 30 мин. Реакцию останавливают путем зам-ораживания смеси в бане из сухого льда-этанола.

Фрагмент Нае 111 длиной 2,8 тыс. оснований (2 мкг) смешивают со 150 пмоль фосфорилированной связки Eco RI и обрабатывают 4 ед. Т4 ДНК лигазы в 12,5 мкл реакционной смеси, содержащей 66 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5), 10 ммоль/л MgCl, 10 ммоль/л дитиотреитола (лигазным буфером) и 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 15 ч. Реакцию останавливают путем разбавления смеси в двадцать раз с помощью буфера Eco RI и путем нагревания смеси при 60°С в течение 10 мин. Добавляют тридцать единиц ограничительного фермента Eco RI и смесь инкубируют при 37°С в течение одного часа, чтобы получить цепкие концы Eco RI. Реакцию останавливают путем

нагревания смеси при 60°С в течение 10 мин.

Потученную таким образом смесь добавляют к 2 мкг предварительно линеаризованной ДИК плачмиды pS С101 и осуществляют фенольную экстракцию. После экстракции эфиром ДНК осаждают этанолом, высушивают под вакуумом и растворяют в 100 мкл лигазного буфера. Смесь нагревают при 37 С в течение 5 мин, и цепкие концы Eco RI ренатурируют путем инкубирования при 4 С в течение 16 ч, а затем при О С в течение одного часа. После добавления АТФ (0,4 ммоль/л конечная концентрация) и 1 ед. Т4 ДНК-лигазы смесь инкубируют при 12,5°С в течение 7 ч.

Четвертую часть легированной смеси используют после этого для трансформации мутайного штамма ТЕ5527 с липопротеиновой делецией E.coli NRRL В-15012, Проводят трансформацию и трансформанты резистентные к тетрациклину выращивают в течение ночи на фильтровальной бумаге Ватман ЗММ, помещенной на поверхности L бульонной чашки, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, и отбирают липопротеи- новые клоны путем гибридизации колоний. Фрагмент MSp 1 длиной 0,95 тыс. оснований Xlpp Ec-1, содержащий ли- попротеиновый ген, подвергают меченой

Для того, чтобы клонировать фра мент Alu I длиной 462 пары основан содержащий участок липопротеиновог промотора в pBR 322, первоначально проводят делецию фрагмента ДНК, ле щего между сайтами отщепления Есо RI и Hind III pBR 322 (содержащими промотор гена тетрациклиневой рези

TQ тентности), используя следующую ме дику: 11 мкг ДНК плазмиды pBR 322 переваривают 11 ед. ограничительно эндонуклеазо Hind III в 200 мкл ре ционной смеси, содержащей 10 ммоль

15 трис-HCl (рН 7,5), 10 ммоль/л MgCl 60 ммоль/л, NaCl, 6 ммоль/л,

Р -Меркаптоэтанол и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина бу фера Hind III переваривают при 37°

2о в течение одного часа. После оконч ния переваривания проводят фенольн экстракцию и ДНК выделяют этанольн осаждением. Чтобы удалить цепкие концы Hind III, ДНК обрабатывают

25 1,5 мкл SI нуклеазы (Miles Laborat ries) в конечном объеме 300 мкл бу фера, содержащего 30 ммоль/л ацета натрия (рН 4,25), 0,3 моль/л NaCl 4 ммоль/л ZnSO буфера S I при 20

30 в течение одного часа. Реакцию ост навливают путем добавления 30 мкл 500 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0) и 30 мкл 250 ммоль/л ЭДТА5 после чег проводят фенольную экстракцию. Что

трансляции с у,-32 р d АТФ и а-32р 35 удалить фенол, смесь экстрагируют

d ЦТФ и его используют как гр-зонд. Было показано, что один из трансформантов, дающих положительную гибридизацию, содержит, плазмиду со структурой и эту плазмиду обозначают pKEN III. Эту плазмиду получают из E.coli.CC620/pKEN III, NRRI-B-15011. Плазмиду можно получить из NRRI-B- 15011 обычным способом.

Родительской плазмидой, выбранной для конструкции плазмиды, выражающей липопротеиновый ген, была pBR 322 (молекулярный вес примерно 2,6 мега- дальтонов), несущая гены резистентно сти к амлициллиновым (Amp) и тетрациклиновым антибиотикам.,

pBR 322 включает сайт расщепления Есо RI, расположенный на 5 конце гена тетрациклиневой резистентности, а также сайт расщепления Hind III, находящийся в промоторе гена тетра- циклиновой резистентности, и сайт отщепления Pvu I, находящийся в гене ампициллиневой резистентности.

эфиром и диализуют против 0, (,15 NaCl+0,015 цитрата натри при 4°С в течение ночи и ДНК удаля этанольным осаждением.

4о Затем добавляют фосфорилированн связку Есо RI (200 мкмоль) и смесь обрабатывают 4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 12,5 мкл лигазного буфера, содержа го 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в те

45 ние 16ч. Цепкие концы Есо RI поме щают в 75 мкл буфера Есо RI при 37°С в течение 2 ч. Реакцию остана ливают путем фенольной экстракции ДНК выделяют этанольным осаждением

5о Цепкие концы Есо RI легируют и плазмиду повторно зажимают путем о работки с 0,3 ед. Т4 ДНК лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержаще 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5°С в течен

55 7 ч. Аликвоту 0,5 мкг легированной ДНК используют для трансформации штамма JE5519, E.coli NRRI В-15013 Р-, aroD, man, argE, lac, gal, rps gyrA, recAl. Десять трансформантов

Для того, чтобы клонировать фрагмент Alu I длиной 462 пары оснований, содержащий участок липопротеинового промотора в pBR 322, первоначально проводят делецию фрагмента ДНК, лежащего между сайтами отщепления Есо RI и Hind III pBR 322 (содержащими промотор гена тетрациклиневой резистентности), используя следующую методику: 11 мкг ДНК плазмиды pBR 322 переваривают 11 ед. ограничительной эндонуклеазо Hind III в 200 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ммоль/л

5 трис-HCl (рН 7,5), 10 ммоль/л MgClt, 60 ммоль/л, NaCl, 6 ммоль/л,

Р -Меркаптоэтанол и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина буфера Hind III переваривают при 37°С

в течение одного часа. После окончания переваривания проводят фенольную экстракцию и ДНК выделяют этанольным осаждением. Чтобы удалить цепкие концы Hind III, ДНК обрабатывают

5 1,5 мкл SI нуклеазы (Miles Laboratories) в конечном объеме 300 мкл буфера, содержащего 30 ммоль/л ацетата натрия (рН 4,25), 0,3 моль/л NaCl и 4 ммоль/л ZnSO буфера S I при 20 С

0 в течение одного часа. Реакцию останавливают путем добавления 30 мкл 500 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0) и 30 мкл 250 ммоль/л ЭДТА5 после чего проводят фенольную экстракцию. Чтобы

удалить фенол, смесь экстрагируют

эфиром и диализуют против 0, (,15 NaCl+0,015 цитрата натрия) при 4°С в течение ночи и ДНК удаляют этанольным осаждением.

Затем добавляют фосфорилированную связку Есо RI (200 мкмоль) и смесь обрабатывают 4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 12,5 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16ч. Цепкие концы Есо RI помещают в 75 мкл буфера Есо RI при 37°С в течение 2 ч. Реакцию останавливают путем фенольной экстракции и ДНК выделяют этанольным осаждением.

Цепкие концы Есо RI легируют и плазмиду повторно зажимают путем обработки с 0,3 ед. Т4 ДНК лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5°С в течение

7 ч. Аликвоту 0,5 мкг легированной ДНК используют для трансформации штамма JE5519, E.coli NRRI В-15013/ Р-, aroD, man, argE, lac, gal, rpsL, gyrA, recAl. Десять трансформантов,

которые были резистентны к ампициллину, чувствительны к тетрациклину, выращивают в течение ночи в 1 мл бульона L, содержащего 50 мкг/мл ампициллина. Плазмидные ДНК выделяют из 0,5 мл культур способом быстрой щелочной денатурации и их анализируют картированием с помощью ограничительного фермента. Выделяют плазмиду рКЕ N005. Фрагмент Alu 1 из 462 пар оснований, содержащий липопротеиновый промотор, получают следующим образом: 100 мкг ДНК плазмиды р KEN III переваривают с ограничительным ферментом MSp 1 в 600 мкл буфера, содержащего 10 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5), 10 ммоль/л MgCla, ммоль/л КС1, 1 ммоль/л дитиотреитола и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (эту смесь называют буфером Нра 1), при 37 С в течение 3 ч. После экстракции фенолом фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, сушат под вакуумом, растворяют в 10 мкл гелевого буфера и фракционируют на 5%-ном полиакрил- амидном геле. Примерно 6 мкг очищенного фрагмента MSp I длиной 0,95 тыс. оснований переворачивают затем с ограничительной эндонуклеазой Д1и I в 400 мкл .буфера Hind III при 37° С в течение 2ч, получив фрагмент Alu I длиной 462 пар оснований, который очищают гель-электрофорезом.

Один микрограмм фрагмента Alu I длиной 462 пар оснований затем смешивают со 150 пмоль фосфорилированной связки Eco RI и обрабатывают 4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5°С в течение 16 ч. Легированную ДНК переваривают с 40 ед. ограничительного фермента Eco RI в 100 мкл буфера Eco RI при 37°С в течение одного часа, чтобы создать цепкие кон- цы Eco RI. Переваривание останавливают путем нагревания смеси при 60°С в течение 10 мин и к смеси добавляют 0,6 мкг переваренной Eco RI ДНК-плазмиды pKEN 0,05 и проводят фенольную экстракцию. ДНК выделяют этанольным осаждением и цепкие концы Eco RI соединяют путем обработки 0,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5°С в течение 7 ч. Легированные ДНК используют для трансформации штамма JE5519E coli NRRL В-1501 и траноформанты отбирают на тетрациклиновую резистентность на чашке с бульоном L, содержащим 12,5 мкг/мл тетрациклина. Анализ пллзмидной ДНК, выделенной из резистентных к тетрациклину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, показывает вставку фрагмента Alu I длиной 462 пар оснований в сайте Eco R pKEN 005, и полученную таким образом одну из плазмид обозначают pKEN 008.

Следующей стадией конструирования клонируемых вектор-но сителей А сайта липопротеинового гена было исключить один из двух сайтов отщепления Есо RI в pKEN 008. Это необходимо для того, чтобы гарантировать единственную точку для вставления для экзогенного гена, выбранного для клонирова ния, сразу же ниже фрагмента Alu I и длиной 462 пар оснований (фрагмент Eco RI), содержащего промотор липопротеинового гена и 5 - непереводимый участок.

4 мкг переваренной Eco RI ДНК плазмиды pBR 322 обрабатывают сначала SI нуклеазой, чтобы удалить цепкие концы Eco RI, а затем бактериальной щелочной фосфотазой, чтобы пр,- дотвратить самолегирование. Затем ДНК смешивают с 0,76 мкг очищенного фрагмента Alu I длиной 462 пар оснований (полученного из PKEN III) и легируют тупые концы с 2,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5° в течение 16 ч. Половину легированной ДНК используют для трансформации штамма JE 5519 E.coli NRRL В-15013, один из трансформантов содержит плазмиду. Эту плазмиду обозначают pKEN 002 и после переваривания 25 мкг ДНК плазмиды pKEN 002 с ограничительными ферментами Pvu I и ХЬа I в 500 мкл буфера, содержащего 6 ммоль/л трис- HCl (рН 7,9), ммоль/л Mg C12, 150 ммоль/л NaCl, 6 ммоль/л 5-меркап- тоэтанола и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (указанную смесь называют буфером Bam HI), при 37 С в течение одного часа очищают гель- электрофорезом фрагмент ДНК длиной 1,04 тыс. оснований Pvu I-Xba I. Фрагмент ДНК длиной 24 пары оснований ХЬа 1-Есо RI получают из pKEN 008 следующим образом: 25 мкг ДНК плазмиды pKEN 008 переваривают с ограничительным ферментом Eco RI длиной 470 пар оснований очищают гель-электу

рофорезом. Один микрограмм фрагмента Eco RI длиной 470 пар оснований затем переваривают с ограничительным ферментом ХЬа I и смешивают с одним микрограммом фрагмента ДНК длиной 1,04 тыс. оснований Pvu I Xba, полученным ранее, а также с 075 микрограммами ДНК плазмиды pKEN 005, предварительно переваренной с ограничительными ферментами Pvu I и Eco RI. Смесь ДНК обрабатывают 0,8 ед. Т4 ДНК-лигазы в 50 мкл лигазного буфера содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5°С в течение 7 ч.

Половину легированной ДНК используют для трансформации штамма JE 5519, E.coli, NRRLB-15013 и выбирают трансформанты, чувствительные к тетрациклину. Анализируют плазмидную ДНК, полученную из 0,5 мл культуры трансформантов, чувствительных к тетрациклину, способом быстрой щелочной денатурации и выделяют плазмиду pKEN 010.

Фрагмент Eco RI длиной 2,8 тыс. оснований получают из ДНК плазмиды pKEN III путем переваривания с ограничительным ферментом Eco RI с последующим фракционированием на полиак- риламидном. геле и 10 мкг этого очищенного фрагмента полностью переваривают с ограничительной эндонуклеазой Pvu II в 500 мкл буфера Нае 111 при 37°С в течение одного часа. Реакцию останавливают посредством фенольной экстракции и смесь экстрагируют эфиром. Фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, подвергают центр фу- гированию, повторно растворяют в 200 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия и повторно осаждают с помощью 0,5 мл этанола. Пять микрограмм переваренного Pvu II фрагмента Eco RI длиной 2,8 тыс. оснований смешивают с 390 пмоль фосфорилированной связки Вага HI и легируют тупые концы с 6 ед Т4 ДНК-лигазы в 25 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5°С в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляют до 150 мкл с помощью буфера Нае 111 и нагревают при 60°С в течение 10 мин, чтобы дезактивировать Т4 ДНК-лигазу. После добавления 60 ед. ограничительного фермента Нае 111 смесь инкубируют при 37°С в течение одного часа.

Поскольку использованная здесь связка Bam HI имела последователь0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

-ность оснований 5 ЦЦГТАТЦЦГТ 3(, последовательность узнавания для ограничительного фермента Нае 111 5 ГГЩ.Г ЦЦГГ создавалась в месте соединения двух любых фрагментов 3 ЦЦГГ5 связки. Таким образом, при использовании указанного ограничительного фермента Нае 111 для переваривания легированных связкой Bam HI фрагментов Pvu III (эти фрагменты не содержат внутренних сайтов отщепления Нае II) осуществляют удаление излишних множественных фрагментов связки Bam HI, связанных с концом Pvu II, при этом остается только один такой фрагмент связки,,непосредственно присоединенный к этому концу. Эта процедура сильно упрощает очистку фрагмента ДНК, содержащего 3 конец липопротеинового гена.

После дезактивации фермента Нае 11 путем нагревания реакционной смеси при 60 С в течение 10 мин фрагменты ДНК полностью переваривают с ограничительным ферментом Нра 1 в 400 мкл буфера Нра 1 при 37 С в течение 2 ч. Реакционную смесь экстрагируют фенолом и фрагменты ДНК осаждают этанолом, сушат под вакуумом, растворяют в 100 мкл гелевого буфера и фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле. Полосу ДНК, которая мигрировала в положение 0,95 тыс. оснований, вырезают из геля, и фрагменты ДНК элюируют из геля электрофорезом. После удаления красителя бромистого этидия с помощью фенольной экстракции, фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, центрифугируют, растворяют в 200 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия, повторно осаждают с помощью 0,5 мл этанола и снова сушат под вакуумом. Выделяют примерно один мкг очищенного фрагмента Нае 111-Нра 1 длиной 0,95 тыс. оснований.

Сто двадцать пикомолей фосфорили- рованной связки Sal I (5 ГГТЦГАЦЦ3 ) смешивают с 0,75 мкг очищенного фрагмента Нае 111-Нра 1 длиной 0,95 тыс. оснований и тупые концы легируют с 3,5 ед. Т4 ДНК-лигазы в 25 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляют достаточным количеством Bam HI буфера, чтобы получить конечный объем 300 мкл, а затем смесь нагревают при 60 С в течение 10 мин. Добавляют дос

И14

таточные количества ограничительных ферментов Bam HI и Sal I и смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч, чтобы получить цепкие концы путем отщепления связок Bam HI и Sal I, присоединенных к концам Pvu II и Нра I соответственно, в результате чего получают фрагмент Bam HI - Sal I длиной 0,95 тыс. оснований. Переваривание ограничительной эндонуклеазой оста-. навливают путем нагревания при 60 С в течение 10 мин.

На этой стадии половину объема смеси (150 мкл), содержащей примерно 0,38 мкг фрагмента Bam HI-Sal I длиной 0,95 тыс. оснований, смешивают с одним микрограммом ДНК-плазмиды pKEN 01 А, которую предварительно переваривают с ограничительными ферментами Bam HI и Sal I и обрабатывают бактериальной щелочной фосфота- зой. Плазмиду pKEN 014 предварительно получают из pBR 322 путем делеции фрагмента Hind III - Bam HI длиной 346 пар оснований (содержащего большую часть гена тетрациклиновой резис- тентности) из pBR 322. Этот фрагмент удаляют, чтобы свести до минимума размер выражаемой плазмиды (примерно 5 тыс. оснований). Делецию этого фрагмента проводят путем переваривания Hind III с последующей обработкой SI в течение одного часа после чего присоединяют связку Bam HI, полностью переваривают Bam HI, повторно циклизуют с помощью Т4 ДНК-лигазы и выбирают трансформанты, чувствительные к тетрациклину .

Смесь линеаризованной ДНК-плазмиды pKEN 014 и фрагментов Bam HI Sal I длиной 0,95 тыс. оснований экстрагируют фенолом, и ДНК осаждают 2,5 обънуклеазоипри 20°С,

0

5

004

12

ночи в одном миллилитре бульона L, содержащим 50 микроорганизмов/мл ампициллина. Плазмидные ДНК выделяют из 0,5 мл культур способом быстрой щелочной денатурации и анализируют агарозным гель-электрофорезом. Было найдено, что пять плазмидных ДНК несут фрагмент Bam HI - Sal I длиной 0,95 тыс. оснований и одну из этих плазмид обозначают pKEN 018.

Следующая стадия при конструировании клонируемых вектор-но сителей А-сайта липопротеинового гена заключается в том, чтобы соединить фрагмент липопротеинового промотора с фрагментом окончания транскрипции в одинаковой ориентации. Эту стадию осуществляют, заменяя фрагмент Pvu I- Eco RI длиной 630 пар оснований pKEN 018 фрагментом Pvu I-Eco RI длиной 1,1 тыс. оснований плазмиды pKEN 010.

Чтобы это осуществить, 20 мкг ДНК-плазмиды pKEN 010 полностью переваривают с ограничительной эндонуклеазой Pvu I в 100 мкл буфера Bam HI при 37 С в течение 1,5 ч. После дезактивации фермента Pvu I посредством 0 нагревания реакционной смеси при 60°С в течение 10 мин, добавляют 52 мкл воды, 40 мкл 0,5 моль/л трис- НС1 (рН 7,5), 4 мкл 0,1 моль/л MgCl2 и 40 ед. ограничительного фермента

Eco RI. Реакционную смесь инкубируют о

0

5

5

0

при 37 С в течение одного часа и переваривание останавливают фенольной экстракцией. Фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, сушат под вакуумом, растворяют в 100 мкл гель- ного буфера и фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле. После элюиро- вания отдельных фрагментов ДНК из геля получают четыре микрограмма очи

Изобретение относится к области биотехнологии ,в частности, к генетической инженерии, и касается конструирования плазмидного вектора для выражения экзогенных генов в трансформированных штаммах бактерий E.COLI. Целью изобретения является получение авторегулируемого стимулируемого вектора. Функциональные элементы данного вектора состоят из липопротеинового гена E.COLI фрагмента стимулируемого промотора LAC - промотора E.COLI, фрагмента ДНК для репрессора, который содержит целый функциональный ген LAC 1 E.COLI, а целевой полипептид выражается в трасформантах E.COLI. 1 табл.

емами этанола, подвергают центрифуги- ,,- щенных фрагментов Pvu I-Eco RI длированию и растворяют в 200 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия. ДНК повторно осаждают с помощью 0,5 мл этанола, центрифугируют и сушат под вакуумом. Цепкие концы фрагментов ДНК ренатурируют с помощью 0,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 60 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,55°С в течение 7 ч. Двенадцать микролитров легированной смеси затем используют для трансформации штамма JE 5519, E.coli, NRRL В-15013, и двенадцать резистентных к ампициллину трансформантов выращивают в течение

50

55

ной 1,1 тыс. оснований.

Очищенный фрагмент (0,75 мкг) затем смешивают с 0,6 мкг ДНК-плазми ды pKEN 018, которую предварительно подвергают двойному перевариванию с ограничительными ферментами Pvu I и Eco RI, а затем обработкой бактериальной щелочной фосфотазой. Цепкие концы Pvu I и Eco RI легируют путем обработки с 0,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 50 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 7 ч. Двадцать пять микролитров легированной смеси используют для транс0

5

ной 1,1 тыс. оснований.

Очищенный фрагмент (0,75 мкг) затем смешивают с 0,6 мкг ДНК-плазмиды pKEN 018, которую предварительно подвергают двойному перевариванию с ограничительными ферментами Pvu I и Eco RI, а затем обработкой бактериальной щелочной фосфотазой. Цепкие концы Pvu I и Eco RI легируют путем обработки с 0,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 50 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 7 ч. Двадцать пять микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма JE 5519 E.coli, NRRL В-15013 и отбирают трансформанты, стойкие к ампициллину. Плазмидные ДНК выделяют из резистентных к ампициллину трансформантов и их анализируют с помощью агарозного гель-электрофореза. Отбирают плазмиду pKEN 021.

pKEN 021 несет как фрагмент липо- протеинового промотора, так и фрагмент окончания липопротеиновой транскрипции, которые разделены фрагментом длиной 32 пары оснований, получены из pBR 322. Посредством делеции последнего фермента и вставки последовательности ДНК, кодирующей целевой полипептид, обеспечивается функциональная группа для выражения целевого полипептида. Однако в силу того, что на концах фрагмента длиной 32 пары оснований находятся сайты отщепления Eco RI и Вага HI, структура плаэмиды pKEN 021 допускает только вставку вставочных фрагментов экзогенной ДНК, имеющих цепкие концы Eco RI-Eco RI, Bam HI или Eco RI-Bam HI. Поэтому, чтобы расширить класс экзогенных генов, которые можно вставлять, чтобы они включали гены, сшиваемые с другими сочетаниями цепких концов, последовательность ДНК на этом участке можно модифицировать и добавить сайт расщепления Hind III между существующими сайтами Eco RI и Bam HI.

Для достижения этого сначала желательно уменьшить размер плазмиды, исключив фрагмент Hind III-Cla I длиной 200 пар оснований в pKEN 021 с помощью следующей методики: пять микрограммов ДНК плазмиды pKEN 021 частично переваривают с одной единицей ограничительного фермента С1а I в 1-0 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0), 10 ммоль/л MgCl и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, при 37 С в течение одного часа. После феноль- ной экстракции и этанольного осаждения цепкие концы С1а 1 удаляют посредством обработки с 600 ед. нукяеа- зы 51 в 200 мкл буфера SI при 20°С в течение одного часа. Реакцию останавливают путем добавления 20 мкл 0,5 моль/л трис-HCl (рН 8,0) и 20 мкл 0,25 моль/л ЭДТА. Смесь экстрагируют фенолом и диализуют в течение четофех часов против 0,. ДНК осаждают 2,5 объемами этанола,

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

центрифугируют и повторно суспендируют в 100 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия. ДНК повторно осаждают 250 мкп этанола, центрифугируют и высушивают под вакуумом.

Затем один микрограмм обработанной SI ДНК смешивают с 70 пмолями фосфоп рилированной связки Hind III . (5 ЦЦААГЦТТГГ1 ) и легируют тупые концы 4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Затем смесь разбавляют до 100 мкл с помощью буфера Hind III и нагревают ее при 60°С в течение 10 мин. Добавляют двадцать единиц ограничительной эндонуклеазы Hind III смесь инкубируют при 37°С в течение одного часа, чтобы удалить избыточные молекулы связки и получают цепкие концы Hind III. Затем реакционную смесь экстрагируют фенолом и ДНК осаждают этанолом. Плазмидные ДНК (0,5 мкг) повторно циклизуют посредством обработки с 0,8 ед. Т4 ДНК-лигазы в 15 мкп лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 7 ч. Восемь микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма Та221 E.coli, NRRL B-15014 /recA L hr h+, AtrpES, thr, leu, thi, lacY.

Чтобы исключить сайт отщепления Hind III pKEN 030, 2,5 мкг ДНК-плаз- миды pKEN 030 переваривают с 5 ед. ограничительного фермента Hind III в 50 мкл буфера Hind III при 37СС в течение одного часа. После феноль- ной экстракции и осаждения этанолом цепкие концы Hind III удаляют путем обработки 400 ед. нуклеазы SI в 200 мкл буфера SI при 20°С в течение одного часа. После выделения ДНК, 0,75 мкг обработанной SI плазмидной ДНК повторно циклизуют посредством обработки 2 ед. Т4 ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5°С в течение 16 ч. Три микролитра легированной смеси используют затем для трансформации штамма ТА221 E.coli, NRRL В-15014, и выделяют плазмиду pKEN 033, которая не содержала сайтов отщепления Hind III.

Последовательность ДНК-плазмиды pKEN 033 модифицируют, чтобы создать сайт отщепления Hind IIT между сайтами Eco RI и Bam HI следующим образом: 5 мкг ДНК-плазмиды pKEN 033 переваривают с 10 ед. ограничительной эндонуклеазы Bam HI в 50 мкл буфера Ват HI при 37РС в течение одного часа. После дезактивации фермента Bam HI путем нагревания реакционной смеси при 60 С в течение 10 мин линеаризованные Лрагменты Д1 К переваривают с 10 ед. фермента Eco PI в 100 мкл буфера Eco RI при 37 С в течение одного часа После Ленольной экстракции и осаждения этанолом, ДНК (3,6 мкл) обрабатывают тремя единицами Т4 ДНК полимеразы в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0), 100 ммоль/л КС1, 6 ммоль/л МрС12 и 6 ммоль/л дитиотреитола (эту реакционную смесь называют полимеразным эфером) в присутствии 0,1 ммоль/л каждого из соединений , dGTP, dCTP и dTTP при 12,5°С в течение 45 мин.

После выделения ДНК добавляют 30 пмолей фосфорилизированной связки Hind III, после чего проводят тупоконечное легирование 4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5°С в течение 16 ч. Затем смесь разбавляют до 100 мкл с помощью буфера Hind III и переваривают со 100 ед. ограничительного фермента Hind III. Смесь инкубируют при 37°С в течение одного часа, чтобы удалить избыточные молекулы связки и получит цепкие концы Hind III, которые потом соединяют (при этом повторно цикли- зуют плазмидные ДНК) посредством об- работки 0,8 мкг ДНК 0,4 ед. Т4 ДНК- лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5°С в течение 7 ч. После трансформации штамма ТА221 Е. coli, NRRL В-15014 с помощью части легированной смеси плазмидные ДНК выделяют из резистентных, ампициллину колоний и плазмиду обозначают pKEN 037. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК pKEN 037 показал, что в последовательности ДНК имеется делеция одно Г-Ц пары между сайтами отщепления Hind III и Bam HI (по неизвестным причинам) и pKEN 037 представляет со бой структурный А-1 клонируемый вектор-носитель .

Для того, чтобы согласовать вставочные фрагменты ДНК с рамками считывания, отличными от рлмок pKEN 037 конструируют клонируемые вектор-носители А-2 и А-3 липопротеинового гена посредством регулирования рамок считывания pKEN 030 в сайте отщепления Eco RI. Эта последовательность включает сайт отщепления Alu I между положениями +45 и +46„ При получении плазмиды pKEN 008 связку Eco RI присоединяют к концу Alu I, получая последовательность ДНК в плазмидах pKEN 008, pKEN 010, pKEN 021 и pKEN 030 и получая сайт отщепления Eco RI между положениями +47 и +48, Последовательность ДНК pKEN 030 модифицируют в сайте Eco RI, чтобы сдвинуть ее рамку считывания на одно и на два основания соответственно.

Чтобы добиться этого результата в первом случае и получить плазмиду с рамкой считывания А-2, 5 мкг ДНК- плазмиды pKEN 030 полностью переваривают с ограничительным ферментом Eco RI в 100 мкл буфера Eco RI при 37 С в течение 60 мин. После феноль- ной экстракции и этанольного осаждения ДНК обрабатывают 3 ед. Т4-полиме разы в 30 мкл полимеразного буфера в присутствии О,1 ммоль/л dGTP и 0,1 ммоль/л dATP при 1 2,5°С в течение 45 мин. Реакцию останавливают путем добавления ЭДТА до конечной концентрации 25 ммоль/л. После чего проводят фе- нольную экстракцию. Таким образом половину 4-основных Eco RI цепких концов заполняют двумя А-остатками0 Остальные два однонитчатых А-остатка удаляют посредством обработки нукле- азой SI в 200 мкл буфера SI при 20 С в течение одного часа. Реакцию останавливают путем добавления 20 мкл 0,5 моль/л трис-HCl (рН 8,0) и 20 мк 0,25 моль/л ЭДТА. Смесь экстрагируют фенолом и диализуют в течение ночи против 0,01х SRC. ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, центрифугируют и повторно суспендируют в 100 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия. ДНК повторно осаждают с помощью 250 мкл этанола, центрифугируют и сушат под вакуумом„

Чтобы восстановить сайт отщепления Eco RI, один микрограмм обработаной SI ДНК сначала смешивают с 70 пмолями фосфорилированной связки Eco RI и тупоконечно легируют с 3,2 ед. Т4 ДНК-лигазой в 11 мкл лига

17

ного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Затем смесь разбавляют до 50 мкл буфером Eco RI и нагревают при 60°С в течение 10 мин. Добавляют двадцать единиц ограничительной эндонуклеазы Eco RI и смесь инкубируют при 37°С в течение одного часа, чтобы удалить избыточные молекулы связки и получить цепкие концы Eco RT. Затем реакционную смесь экстрагируют фенолом и ДНК осаждают этанолом. Плазмидные ДНК (0,5 мкг) повторно циклизуют посредством обработки с 0,8 ед. Т4 ДНК-лигаэы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ, при 12,5°С в течение 7 ч. Восемь микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221 Е. coli, NRRL В-15014. Плазмидные ДНК очищают из 3 трансформантов резистентных к ампициллину, которые выращивают в течение ночи в 100 мл бульона L, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, определяют последовательности ДНК в их сайтах отщепления Eco RI, выделяют плазмиду и обозначают pKEN 024 (А-2).

Чтобы сконструировать плазмиду с рамкой считывания А-3 5 мкг ДНК- плазмиды pKEN 030 полностью переваривают с ограничительным ферментом Eco FT в 100 мкл буфера Eco RI при 37°С в течение 60 мин. После феноль- ной -экстракции и этанольного осаждения цепкие концы Eco PI удаляют посредством обработки ДНК (4,4 мкг), 500 ед. куклеазы SI в 150 мкл буфера SI при 20°С в течение одного часа. Реакцию останавливают путем добавления 15 мкл 0,5 моль/л трис-НС1 (рН 8,0) и 15 мкл 0,25 моль/л ЭДТА, Смесь экстрагируют фенолом и диали- зуют в течение четырех часов против 0,01 SSC. ДНК осаждают с помощью 2,5 объемов этанола, центрифугируют и повторно суспендируют в 100 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия. ДНК повторно осаждают 250 мкл этанола, центрифугируют и высушивают под вакуумом.

Чтобы восстановить сайт отщепления Eco RI, один микрограмм обработанной SI ДНК смешивают с 240 пмоля- ми фосфорилированной Eco RI связки и легируют тупые концы с помощью 4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ пр

14

10

15

20

25

79004 18

12,5вП в течение 16 ч. Затем ГМРГЬ разбавляют до 250 мкл буфером Eco RI и нагревают при 60° С. в течение 10 мин Добавляют сто единиц ограничителей эндонуклеазы Eco FT и смесь инкубируют при 37°С в течение одного часа, чтобы удалить избыточные молекулы связки и получить цепкие концы Eco RI Затем реакционную смесь экстрагируют фенолом и ДНК осаждают этанолом, Плазмидные ДНК (0,3 мкг) повторно циклизуют посредством обработки 0,8 ед. Т4 ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,5 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 7 ч. Восемь микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221 Е. coli, NRRL B-15014. Плазмидные ДНК очищают из 3 трансформантов, резистентных к ампициллину, которые выращивают в течение ночи в 100 мл бульона L, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, и после этого определяют последовательности ДНК в их сайтах отщепления Eco RI. Была выделена плазмида, которую обозначают pKEN 036 (А-3).

Чтобы изменить трансляционную рамку считывания pKEN 037 (0-1) на две другие рамки считывания (А-2 и А-3), меньший фрагмент ХЪа I - Eco RI pKEN 037 заменяют меньшими фрагментами ХЪа I - Eco R1 из pKEN 024 (А-2) или из pKEN 036 (А-3), 3 мкг pKEN 037 сначала переваривают с 6 ед. ограничительного фермента ХЪа I в 50 мкл буфера Bam HI при 37°С в течение одного часа, а после дезактивации фермента ХЬа I фрагменты линеаризованной ДНК переваривают с 6 ед. ограничительного фермента Eco RI в 100 мкл буфера Eco RI при 37°С в течение одного часа. Больший фрагмент Xba I - Eco RI отделяют от меньшего фрагмента посредством агарозного гель-электрофореза, фрагменты ДНК в агарозном геле красят бромистым этидием (один мкг/мл) и вырезают полосу, соответствующую большему фрагменту. Фрагменты ДНК в этой полосе элюируют из геля после замораживания. Бромистый этидий удаляют из фрагментов ДНК фе- нольной экстракцией и ДНК выделяют этанольным осаждением.

Высушенные фрагменты ДНК растворяют в 20 мкл воды и аликвоты в один микролитр смеси этого фрагмента ДНК pKEN 037 смешивают с 0,1 мкг каждого

30

35

40

45

50

55

19

из меньших ограничительных фрагментов Xba I - Eco RI, предварительно полученных из pKEN 024 или pKEN 036 путем двойного переваривания каждой плазми- ды ограничительными ферментами Xba I и Eco RI с последующей гелевой очисткой. Цепкие концы фрагментов Xba I - Eco RI соединяют путем обработки 0,2 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ, при 12,5°С в течение 7 4j после чего часть легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221 Е. coli, NRRL В-15014. Среди резистентных к ампициллину трансформантов получают плазмидные ЛКК, имеющие рамки считывания А-2 и А-3 (их обозначили pKEN 039 и pKEN 040 соответственно).

Указанное представляет собой экспериментальную методику, которую используют в первом случае для конструирования плазмиды pKEN 039 (А-2) и pKEN 040 (А-3).

В частности, последовательность ДНК в окрестности сайта отщепления плазмиды pKEN 037 (А-1) изменяют, чтобы непосредственно получить структуру плазмиды pKEN 039 (А-2) или pKEN 040 соответственно.

Первая стадия при конструировании В-сайтовых выражаемых плазмид заключается в конструировании плазмиды, служащей источником фрагментов ли- попротеинового гена и имеющей сайт отщепления ограничительного сЬермента вблизи сайта отщепления сигнального пептида. Выбранный ген кодирует липопротеин S. marcescens и имеет последовательность узнавания Fnu 4Н-1 ограничительной эндонуклеазы на З1-конце сигнального пептида.Была выбрана плазмида pBR 322 для приема липопротеинового гена S. marcescens .

2 мкг ДНК-плазмиды pBR 322 переваривают до конца с двумя единицами ограничительной эндонуклеазы Ban HI в 50 мкл буфера Bam HI при 37е С в течение 60 мин. После дезактивации фермента Bam HI посредством нагревания при 60°С в течение 10 мин добавляют 2 ед. Eco RI и 100 мкл буфера Eco RI. Затем смесь инкубируют при 37°С в течение 60 мин, а реакцию останавливают фенольной экстракцией, после чего фрагменты линеаризованной ДНК выделяют этанольным осаждением.

7900420

Фрагмент ДНК длиной 8,5 тыс. оснований, содержачшй липопротеиновый ген R. marcescens, выделяют отдельно из гибридного -фага, несущего липопротеиновый ген S. marcescens (обозначенный Л I ppSm-1) . Липопротеиновый ген предварительно клонировали в вектор -фаг Charon 14 следующим обраJQ зом. Всю ДНК (200 мкг), выделенную из S. marcescens, переваривают с 200 ед. ограничительного фермента Eco PI. Фрагменты ДНК разделяют на препаративном агарозном геле и соби15 рают фракции фрагментов ДНК длиной примерно 8,5 тыс. оснований, которые проявляют положительную гибридизацию с 5 32 р липопротеиновой и-РНК в южном способе гибридизации. Смесь фраг20 ментов Eco RI длиной 8,5 тыс. оснований (обогащенную примерно в двадцать раз) и отщепленной Eco RI векторной ДНК Charon 14 обрабатывают Т4 ДНК-ли- газой. Легированную ДНК используют

25 для трансформации штамма К802 Е. coli, NRRL В-15016. Рекомбинантные фаги, несущие липопротеиновый ген, высевают способом зонной гибридизации Бентона и Дэвиса, используя

30 5 Р-липопротеиновую и-РНК. Одну из изученных зон, которая дала положительную гибридизацию, обозначают как AlppSm-l.

Два микрограмма ДНК IppSm-l затем полностью переваривают с ограничительными ферментами Bam HI и Eco RI таким же образом, как и в отношении линеаризации pBR 322, и 0,5 мкг фрагментов ДНК AlppSm-1 смешивают с

40 мкг предварительно линеаризованной ДНК плазмиды pBR 322 в 40 мкг лигазного буфера. Смесь нагревают при 37°С в течение 5 мин и цепкие концы Fco RI и Bam FT ренатурируют

35

инкубированием при С в течение

16 ч, а затем при 0°С в течение 1 ч. После добавления АТф (конечная концентрация 0,4 ммоля/л) и 0,4 ед. Т4 ДКК-лигазы смесь инкубируют при 12,5°С в течение 7 ч.

Четвертую часть легированной смеси используют после этого для трансформации мутантного штамма ТЕ5527 с липопротеиновой делецией Е. coli, NRRL В-15012. Трансформацию проводят и резистентные к ампициллину трансформанты выращивают в течение ночи на фильтровальной бумаге Ватман ЗММ, помещенной на поверхность бульона

21i4

L, содержащего 50 мкг/мл ампициллина и отбирают липопротеиновые клоны путем гибридизации колоний. Фрагмент Msp I длиной 0,95 тыс, оснований 1рр Ее-1, содержащий липопротеиновы ген, подвергают меченной трансляции с (ci-32p) dATP и (oi,-32P) dCTP и его используют в качествеЭ1р-зонда. Было получено, что один из трансформантов который дает положительную гибриди- дацию, содержал плазмиду (эту плазми ду обозначают pKEN 221).

Чтобы сконструировать В-сайтовые клонируемые вектор-носители, фрагмент Fnu 4Н-1 длиной 329 пар оснований, содержащий липопротеиновый промотор и 5 -непереводимый участок, а также участок сигнального пептида липопротеинового гена S. marcescens клонируют в pKEN 0,005 следующим образом: 80 мкг ДНК-плазмиды pKEN 221 переваривают до конца со 100 ед. ограничительной эндонуклеазы Fnu 4H-1 в 400 мкл буфера Нае III и фрагмент Fnu 4H-1 длиной 324 пары оснований очищают электрофорезом на акриламид- ном геле.

Поскольку переваривание ограничительного фермента Fnu 4H-1 приводи к образованию фрагментов с цепкими концами на обоих концах, эти цепкие концы заполняют Т4 ДНК полимеразой, чтобы получить тупые концы. Два микрограмма очищенного фрагмента Fnu 4Н-1 длиной 324 пары оснований обрабатывают 3 ед. Т4 ДНК полимеразы в 20 мкл полимеразного буфера в присутствии О,1 ммрль/л каждого из dATP, dGTP, dCTP и dTTP при 12,5°С в течение 45 мин. После фенольной экстракции и этанольного осаждения фрагменты ДНК смешивают с 400 пмоля ми фосфорилированной связки Eco RI и обрабатывают 4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5°С в течение 16 ч. Смесь разбавляют до 300 мкл буфером Eco RI и переваривают с 150 ед. ограничительного фермента Eco RI, чтобы получить цепкие концы Eco RI«

Один микрограмм обрабатывают Eco RI фрагментом, затем смешивают с 0,5 мкг обработанной Eco RI ДНК- плазмиды pKEN 005 и обрабатывают смесь 0,4 ед. Т4 ДНК-лиглзы в 40 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при К ,5° Г в тече

04

22

ние 16 ч. Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТЕ 5519 Е. coli, NRRL В-15013. При анализе ограничительным ферментом плазмидной ДНК, полученной из резистентных к тетрациклину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, выясняют, что

Q плазмкда несет фрагмент Eco RI длиной 344 пар оснований, полученный из фрагмента Fnu 4H-1 длиной 329 пар оснований (эту плазмиду обозначают pKEN 009). Анализ нуклеотидной после5 довательности ДНК-плазмиды pKEN 009 показывает, что сайт Eco RI и pKEN 099 находится в В-вставочном сайте и соответствует рамке считывания В-1 . По причинам, которые в настоя0 щее время не ясны, три пары оснований вставлены в участок в положении +90 (что привело к добавлению одного лишнего аминокислотного остатка в этом положении) и лишняя пара Г-Ц

5 вставлена в положение + 99. Удивительным кумулятивным эффектом этих изменений было превращение аминокислотной последовательности на участке сайта отступления сигнального пеп

0 тида из соответствующего участка липопротеинового гена S. marcescens в соответствующий участок липопротеино вого гена Е, coli.

Чтобы сконструировать В-сайтовые выражаемые плазмиды, соответствующие рамкам считывания В-2 и В-3, исключают один из двух сайтов отщепления Eco RI pKEN 009. Этот способ включает перенос фрагмента Xba I - Есо

g RI длиной 80 пар оснований (содержащего сигнальный пептид и часть 5- непереводимого участка липопротеинового гена S. marcescens) из pKEN 009 в сайты Xba I - Eco RI pKEN 010.

г Для осуществления этого 5 мкг ДНК плазмиды pKEN 010 сначала переваривают с 5 ед. ограничительной эндонуклеазы Xba I в 50 мкл буфера Bam HI, после чего переваривают с 5 ед. ограничительного фермента Eco RI в 100 мкг буфера Eco RI. Затем линеаризованную ДНК обрабатывают 5 мкг бактериальной щелочной фосфотазы в 100 мкл 10 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0) и 0,1 ммоль/л ЭДТА при 37 с в течение 30 мин. Плазмидные ДНК экстрагируют фенолом и осаждают этанолом и 0,5 мкг ДНК смешивают с 0,2 мкг фрагмента Xba I - Eco RI длиной 80 пар основа5

0

ний, который получили предварительно путем переваривания 50 мкг ДНК-плаз- миды pKEN 099 ограничительными ферментами Eco R и ХЪа I, после чего проводят электрофорез полиакриламидного геля. Смесь ДНК обрабатывают 0,4 ед. ТА ДНК-лигазы в 40 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммсть/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТЕ5519 Е. coli, NRRL В-15013. При ограничительном ферментативном анализе плазмидных ДНК, полученных из рези- стентных, к ампициллину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации находят, что одна плазмида содержит нужный фрагмент Xba I - Eco RI длиной 80 пар оснований, несущий участок сигнального пептида липопроте инового гена S. marcescens в рамке считывания В-1 (эту плазмиду обозначают pKEN 017).

Рамку считывания в В-вставочном сайте в pKEN 017 затем модифицируют, чтобы получить плазмиды, соответствующие рамкам считывания В-2 и В-3, в соответствии с описанными способами изменения рамки считывания А-1 на рам ки считывания А-2 или А-3 соответственно. Те же способы, которые используют для получения плазмид pKEN 024 (А-2) и pKEN 036 (А-3) из плазмиды pKEN 030 (А-1), можно также использо- вать для получения плазмид pKEN 026 (В-З)и pKEN 037 (В-2) из плазмиды pKEN 017 (В-1).

Последняя стадия конструирования сайтовых векторов заключается в за- мене А-сайтового фрагмента pKEN 037 Xba I - Eco RI одним из трех различных В-сайтовых фрагментов Xba I - Eco RI pKEN 017, pKEN 026 и pKEN 027.

Это нужно для того, чтобы получить В-сайтовые плазмиды с такими же последовательностями узнавания ограничительных ферментов Eco RI, Kind III и Bam HI во вставочном сайте экзогенной ДНК, какие имеются в А-сайте плазмид. Каждый из трех В-сайтовых фрагментов, полученных из pKEN 017, pKEN 026 и pKEN 027, содержит последовательность ДНК, включающий сигнальный пептид, полученный из фрагмента Fnu липопротеинового гена S. marcescens.

Для достижения этого используют такую же методику получения большего фрагмента Xba I - Eco RI плазмиды pKEN 037, Аликвоты в один микролитр водной смеси фрагмента ДНК pKEN 037 смешивают по отдельности с различными меньшими фрагментами Xba-I - Eco RI (примерно О,1 мкг каждого), предварительно полученными из pKEN 017, pKEN 026 и pKEN 027 соответственно путем двойного переваривания с ограничительными ферментами ХЪа I и Eco RI с последующей гелевой очисткой„ Каждую смесь ДНК обрабатывают 0,2 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л AT, при 12,5 С в течение 16 ч. Десять микролитров каждой легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221 Е. coli NRRL В-15014. Из резистентных к ампициллину трансформаторов очищают плазмидные ДНК, имеющие рамки считывания В-1, В-2 и В-3, и их обозначают pKEN 041, pKEN 047 и pKEN 048 соответственно.

Чтобы сконструировать С-сайтовые клонируемые вектор-носители, фрагмент Sau ЗА длиной 193 пары оснований, содержащий липопротеиновый промотор и 5 -непереводимый участок, а также участок.сигнального пептида и первые восемь структурных кодонов липопротеинового гена Е. coli, сначала клонируют в pKEN 005 следующим образом: 200 мкг ДНК-плазмиды pKEN 111, полученной обычным образом из Е. coli CC620/pKEN. Ill, NRRL B-15011, переваривают до конца с 200 ед. ограничительной эндонуклеазы Sau ЗА в 400 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5), 10 ммоль/л MgCl, 60 ммоль/л NaCl и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, при 37°С в течение одного часа. После окончания переваривания проводят фенольную экстракцию. ДНК выделяют этанольным осаждением и фрагмент Sau ЗА длиной 193 пары оснований очищают электрофорезом акриламидного геля. i

Поскольку переваривание ограничительного фермента Sau ЗА приводит к образованию фрагментов с цепкими концами на обоих концах, эти цепкие концы заполняют Т4 ДНК-полимеразой, чтобы получить тупые концы. Два микрограмма очищенного фрагмента Sau ЗА длиной 193 пары основания обрабатывают 3 ед. Т4 ДНК-полимеразы в 20 мкл

полимеразного буфера и присутствии 0,1 ммоль/л каждого из dATP, dGTP, dCTP и dTTP при 12,5°С в течение 45 мин. После фенолъной экстракции и этанольного осаждения фрагменты ДИК смешивают с 400 пмолями Лосфорилиро- ваиной связки Eco RI и обрабатывают 4 ед. Т4 ДПК-лигазы в 20 мкл лигаз- ного буфера, содержашего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Смес

разбавляют до 300 мкл буфером Eco RI и переваривают с 150 ед. ограничительного фермента Eco RI, чтобы получить цепкие концы Eco RI.

Один микрограмм обработанных Eco RI фрагментов затем смешивают с 0,5 мкг обработанной Eco RI ДНК-плаз- миды pKEN 005 и обрабатывают полученную смесь 0,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 40 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5°С в течение 16 ч. Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТЕ5519 Е. coli, NRRL 25 одна плазмида содержит нужный фраг- В-15103. При ограничительном фермен- мент Xba I - Eco PI длиной 106 пар

)0 ния 50 мкг ДНК-плазмиды pKEN 006 ог раничительными ферментами Eco RI и Xba I с последующим электрофорезом полиакриламидного геля. Смесь ДНК о рабатывают 0,4 ед. Т4 ДНК-лигпзы в

15 40 мкл лигазного буфера, содержащег 0,4 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течен 7 ч. Двадцать микролитров легирован ной смеси используют для трансформа ции штамма ТЕ5519, Е. coli, NRRL В-15013. При ограничительном фермен тативном анализе плазмидных ДНК, по лученных из резистентных к ампицилл ну трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, находят,что

тативном анализе плазмидных ДНК, полученных из резистентных к тетрациклину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, выявляют, что одна из плазмид несет фрагмент Eco RI, полученный из фрагмента Sau ЗА длиной 193 пары оснований, и эту штазмиду обозначают pKEN 006. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК- плазмиды pKEN 006 показал, что сайт Eco RI и pKEN 006 находится в С-вста- вочном сайте и соответствует рамке считывания С-1.

Чтобы сконструировать С-сайтовые выражаемые плазмиды, соответствующие рамкам считывания С-2 и С-3, сначала исключают один из двух сайтов отщепления Eco RI и pKEN 006. Этот способ содержит перенос фрагмента Xba I - Eco RI длиной 106 пар оснований (со- держар1его сигнальный пептид, часть 5 непереводимого участка и часть структурной последовательности ли- попротеинового гена Е. coli) от pKEN 006 в сайты Xba I - Eco RI и pKEN 010.

Для осуществления этого 5 мкг ДНК-плазмиды pKEN 010 переваривают с 5 ед. ограничительной эндонуклеазы Xba I в 50 мкл буфера Bam HI, после чего переваривают с 5 ед ограничительного фермента Eco RI в 100 мкл буфера Eco RI. Затем линеаризованную

35

оснований, несущий участок сигнального пептида липопротеинового гена Е. coli в рамке считывания С-1 и эт

30 плазмиду обозначают pKEN 007.

Рамку считывания в С-вставочном сайте в pKEN 007 изменяют, чтобы по лучить плазмиды, соответствующие рам кам считывания С-2 и С-3, согласно описанным способам изменения рамки считывания А-1 на рамки считывания А-2 или А-3 соответственно.

Способы, которые используют для получения плазмид pKEN 024 (А-2) и

40 PKEN 036 (А-3) из плазмиды pKEN 030 (А-1), можно использовать для получения плазмид pKEN 046 (С-2) и pKEN 019 (С-3) из плазмиды pKEN 007 (С-1).

Последняя стадия конструирования С-сайтовых выражаемых плазмид заключается в использовании каждого из трех различных фрагментов С-сайта Xba I - Eco RI pKEN 007, pKEN 046 и pKEN 019 вместо фрагмента А сайта Xba I - Eco RI pKEN 037. Это делают для того, чтобы С-сайтовые плазмиды содержали те же последовательности узнавания ограничительных ферментов Eco RI, Hind IIT и Bam HI, как и пла миды А-сайта и В-сайта. Каждый из трех С-сайтовых фрагментов, полученных из pKEN 007, pKEN 046 и pKEN 019 содержит последовательность ДНК, вкл

45

50

55

0 5 одна плазмида содержит нужный фраг- мент Xba I - Eco PI длиной 106 пар

Д11К обрабатывают 5 мкл бактериальной щелочной фосфатязы в 100 мкл 10 ммоль/л трис-HCl (pll 8,0) н О,1 ммсль/л ЭДТА при 87 Г в течение 30 мин. Плазмидные ДНК смешивают с 0,2 мкг фрагмента Xba I - Eco RT длиной 106 пар оснований, который предварительно получают путем переварива0 ния 50 мкг ДНК-плазмиды pKEN 006 ограничительными ферментами Eco RI и Xba I с последующим электрофорезом полиакриламидного геля. Смесь ДНК обрабатывают 0,4 ед. Т4 ДНК-лигпзы в

5 40 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 7 ч. Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТЕ5519, Е. coli, NRRL В-15013. При ограничительном ферментативном анализе плазмидных ДНК, полученных из резистентных к ампициллину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, находят,что

5

оснований, несущий участок сигнального пептида липопротеинового гена Е. coli в рамке считывания С-1 и эту

0 плазмиду обозначают pKEN 007.

Рамку считывания в С-вставочном сайте в pKEN 007 изменяют, чтобы получить плазмиды, соответствующие рамкам считывания С-2 и С-3, согласно описанным способам изменения рамки считывания А-1 на рамки считывания А-2 или А-3 соответственно.

Способы, которые используют для получения плазмид pKEN 024 (А-2) и

0 PKEN 036 (А-3) из плазмиды pKEN 030 (А-1), можно использовать для получения плазмид pKEN 046 (С-2) и pKEN 019 (С-3) из плазмиды pKEN 007 (С-1).

Последняя стадия конструирования С-сайтовых выражаемых плазмид заключается в использовании каждого из трех различных фрагментов С-сайта Xba I - Eco RI pKEN 007, pKEN 046 и pKEN 019 вместо фрагмента А сайта Xba I - Eco RI pKEN 037. Это делают для того, чтобы С-сайтовые плазмиды содержали те же последовательности узнавания ограничительных ферментов Eco RI, Hind IIT и Bam HI, как и плазмиды А-сайта и В-сайта. Каждый из трех С-сайтовых фрагментов, полученных из pKEN 007, pKEN 046 и pKEN 019, содержит последовательность ДНК, вклю5

0

5

27

чающую сигнальный пептид, полученный из Sau ЗА фрагмента липопротеино- вого гена Е, coli.

Аликвоты в один микролитр водной смеси фрагментов ДНК pKEN 037 смешива ют по отдельности с различными меньшими фрагментами ХЪа I - Eco RI (примерно 0,1 мкг каждый), предварительно полученными из pKEN 007, pKEN 046 и pKEN 0,19 соответственно посредством двойного переваривания с ограничительными ферментами ХЬа I и Eco RI с последующей гелевой очисткой. Каждую смесь ДНК обрабатывают 0,2 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л , при 12,5°С в течение 16 ч. Десять микролитров каждой легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221 Е. coli, NRRL В-15014. Из резистентных к ампициллину трансформантов выделяют плазмидные ДНК, имеющие рамки считывания С-1, С-2 и С-3 и их обозначают pKEN 042, pKEN 043 и pKEN 044 -соответственно.

П р и м е р 2. Лак uv 5 промотор- оператор получают из плазмида рОР203- 3. Лак uv 5 промотор-оператор получают из штамма Е. coli 4288 гее А/рКМООб, NRRL B-15017. Лак uv 5 промотор-оператор переносят на фрагменте ХЬа I длиной 95 пар оснований плазми- ды рКМ 006. Плазмиду получают обычным образом из NRRL В-15017 и после этого известными способами выделяют фрагмент ХЬа I длиной 95 пар оснований.

Лак uv 5 промотор-оператор вставляют в сайт отщепления ХЪа I pKEN 037 40 двух сайтов отщепления ХЪа 1 в pKEN

(в 5 -непреводимый участок липопроте- инового гена) следующим образом: 200 мкг ДКК-плазмиды рОП203-3 переваривают до конца с 200 ед. ограничительного фермента Alu 1 в 400 мкл бу- фера Hind III, и очищают электрофорезом полиакриламидного геля фрагмент Alu I длиной 95 пар оснований, несущий участок лак uv 5 промотора и оператора. Один микрограмм фрагмента Alu I длиной 95 пар оснований смешивают с 400 пмолями фосфорилированной ХЪа I фосфорилированной связки (5 ЦТЦТАГАГ9) и легируют тупые концы с 5 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5°С в течение 16 ч.

Легированную смесь разбавляют до 300 мкл буфером Bam HI и нагревают при

50

55

038, окружающих фрагмент лак-промотора-оператора. Сайт отщепления Xba расположенный выше фрагмента лак- промотора-оператора, исключают. Это осуществляют, используя тот факт, чт присоединение связки ХЬа Т к фрагмен ту лак-промотора-оператора длиной 95 пар оснований приводит к появлению нового сайта отщепления sst I только на конце лак-промотора, распо ложенного выше, а не ниже. Последова тельность узнавания ограничительного фермента SSt I перекрывается с анало гичной последовательностью фермента ХЪа I. Таким образом, делеция 4-основного цепкого конца сайта отщепления SSt I с помощью нуклеазы S I при водит к делении части последовательности узнавания ХЬа I, что равносиль

-

10

900428

60°С в течение 10 мин. Затем смесь обрабатывают 100 ед. ограничительного фермента ХЬа I при 37 Г, в течение одного часа, чтобы получить цепкие концы ХЬа I. Смесь экстрагируют фенолом, осаждают этанолом и лиофилизируют. Затем фрагменты ДНК растворяют в 10 мкл воды и 0,3 мкг полученного таким образом лак-фрагмента смешивают с 0,5 мкг ДНК-плазмиды pKEN 037, которую предварительно переваривали с ограничительным ферментом ХЬа I. Смесь обрабатывают 0,4 ед, Т4 ДНК- лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л AT, при 12,5 С в течение 16 ч, чтобы рена- турировать ХЪа I цепкие концы, посредством чего повторно циклизуют плазмиду. Десять микролитров легированной смеси используют для трансформации Е. coli ТА221/У1lac l , NRRL B-15015, который конструируют

15

20

25

путем переноса -, , л -. +

F , фактора от Х90/

F lac l lac4 pro

При ограничительном ферментативном анализе плазмидных ДНК из резистентных к ампициллину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации

30 выявляют, что одна из них содержит одну копию фрагмента Alu I длиной 95 пар оснований, вставленную в сайт Xba I pKEN 037 в правильной ориентации и эту плазмиду обозначают

35 pKEN 038.

Чтобы упростить конструкцию, стимулируемых плазмид, содержащих В и С вставочные сайты, удаляют один из

0

5

038, окружающих фрагмент лак-промотора-оператора. Сайт отщепления Xba I расположенный выше фрагмента лак- промотора-оператора, исключают. Это осуществляют, используя тот факт, что присоединение связки ХЬа Т к фрагменту лак-промотора-оператора длиной 95 пар оснований приводит к появлению нового сайта отщепления sst I только на конце лак-промотора, расположенного выше, а не ниже. Последовательность узнавания ограничительного фермента SSt I перекрывается с аналогичной последовательностью фермента ХЪа I. Таким образом, делеция 4-основного цепкого конца сайта отщепления SSt I с помощью нуклеазы S I приводит к делении части последовательности узнавания ХЬа I, что равносиль

10

20

25

30

но эффективному исключению сайта отщепления ХЬа I.

Для достижения этого пять микрограммов ДНК плазмиды pKEN 038 переваривают с 10 ед. ограничительной эн- донуклеазы SSt I в 50 мкл буфера Ban HI и обрабатывают 500 ед. нукле- азы R I в 200 мкл буфера S I при 20 °С в течение одного часа. Тупые концы соединяют путем обработки 0,5 мкг обработанной S I ДНК 5 ед, Т.4 ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТЛ, при 12,5° С в течение 16 ч. Пять микро 15 литров легированной смеси используют для трансформации штамма ТД221/ F lac I Е. coli, NRRL В-15015. После проведения ограничительного ферментативного анализа плазмидных ДНК, полученных из резистентных к ампициллину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, находят плазмиду, которую обозначают pKEN 045 (pIN-II A-l).

Существует несколько способов конструирования pIN-II плазмид, соответствующих рамкам считывания А-А и А-3. Полагая доступность плазмид pTN-I А-2 и А-3, в одном способе вставляют фрагмент лак-промотора-оператора в плазмиды pKEN 039 и pKEN 040 в связи с плазмидой pKEN 037. Б альтернативном и предпочтительном способе переносят меньшие фрагменты Xba I - Eco RI pKEN 039 и pKEN 040 в сайт Xba I - Eco RI плазмиды рКЕ 045, получают плазмиды pKEN 049 (pIN-II, А-2) и pKEN 050 (pIN-II, А-3).

Последовательность ДНК в окрестности сайта отщепления Eco RI pKEN 045 модифицируют, чтобы непосредственно получить структуру плазмид pKEN 049 (А-2) или pKEN 050 (А-3), соответственно. Это наиболее предпочтитель-д5 ный способ конструирования этих плазмид, поскольку для него не нужно предварительно конструировать соответствующие структурные плазмиды.

Полагая, что уже сконструированы соответствующие pIN-I плазмиды, каждую из них можно модифицировать, чтобы вставить фрагмент лак-промотора- оператора либо, что более предпочтительно, можно меньший фрагмент Xba I - Eco RI pKEN 045 (pIN-II,A-l) последовательно заменить меньшими фрагментами Xba I - Eco RI из каждой из структурных плазмид В-спйта и С

+7900430

сайта, что дает в любом глучае pIN-II плазмиды согласно таблице

35

40

55

Наиболее предпочтительно конструировать pIN-II выражаемые плазмиды без предварительного получения соответствующих pIN-I плазмид. В случае вставочного сайта В плазмиду pKEN 051 (pIN-II, B-l) получают из плазмиды pKEN 22 сначала путем переваривания ДНК плазмиды pKEN 221 ограничительным ферментом Fnu 4H-1, а затем путем присоединения цепких концов Eco PI к концам полученного фрагмента в соответ ствии с описанным способом. Полученный таким образом фрагмент Eco RI переваривают ограничительным ферментом Xba I, расщепив фрагмент на два в сайте расщепления Xba I, находящемся в 5 -непереводимом участке. Очищая полученный таким образом меньший фрагмент Xba I - Eco RI и используя его вместо меньшего фрагмента Xba I - Eco RI pKFN 045 (pTN-II, A-l), получают B-l стимулируемый клонируемый вектор-носитель. Полученную плазмиду pKEN 051 (pIN-Тт, в-1)затем модифицируют, чтобы получить pIN-T.I плазмиды, соответствующие рамкам считывания В-2 и В-3, pKEN 052 и pKEN 053 соответственно.

Аналогичным путем можно следовать чтобы получить pIN-II плазмнды С-сай- та непосредственно без первоначального конструирования соответствующих pIN-I плазмид. После переваривания ДНК плазмиды pKEN-III ограничительным ферментом Sau ЗА и присоединения цепких концов Eco RI к концам полученного фрагмента полученный таким образом фрагмент Eco RI переваривают ограничительным ферментом Xba I, расщепив фрагмент на два в сайте расщепления ХЪа I (расположенном в 5 - непереводимом участке). Фрагмент Xba I RI, несущий участок сигнального пептида, затем вставляют в сайт

20

25

30

15

5

35

40

5

Наиболее предпочтительно конструировать pIN-II выражаемые плазмиды без предварительного получения соответствующих pIN-I плазмид. В случае вставочного сайта В плазмиду pKEN 051 (pIN-II, B-l) получают из плазмиды pKEN 22 сначала путем переваривания ДНК плазмиды pKEN 221 ограничительным ферментом Fnu 4H-1, а затем путем присоединения цепких концов Eco PI к концам полученного фрагмента в соответствии с описанным способом. Полученный таким образом фрагмент Eco RI переваривают ограничительным ферментом Xba I, расщепив фрагмент на два в сайте расщепления Xba I, находящемся в 5 -непереводимом участке. Очищая полученный таким образом меньший фрагмент Xba I - Eco RI и используя его вместо меньшего фрагмента Xba I - Eco RI pKFN 045 (pTN-II, A-l), получают B-l стимулируемый клонируемый вектор-носитель. Полученную плазмиду pKEN 051 (pIN-Тт, в-1)затем модифицируют, чтобы получить pIN-T.I плазмиды, соответствующие рамкам считывания В-2 и В-3, pKEN 052 и pKEN 053 соответственно.

Аналогичным путем можно следовать чтобы получить pIN-II плазмнды С-сай- та непосредственно без первоначального конструирования соответствующих pIN-I плазмид. После переваривания ДНК плазмиды pKEN-III ограничительным ферментом Sau ЗА и присоединения цепких концов Eco RI к концам полученного фрагмента полученный таким образом фрагмент Eco RI переваривают ограничительным ферментом Xba I, расщепив фрагмент на два в сайте расщепления ХЪа I (расположенном в 5 - непереводимом участке). Фрагмент Xba I RI, несущий участок сигнального пептида, затем вставляют в сайт

31147

Xba I - Eco RI pKEN 045, получив плаз миду pKEN 054 (pIN-II, C-l).

Первая стадия конструирования А-1 выражаемой плазмиды серии pIN-TII заключается в клонировании гена lac I в pBR 322. Чтобы получить это, фрагмент ДНК длиной 5,1 тыс. оснований, содержащий ген lac l, получают из плазмиды pF В140 следующим образом: 15 мкг ДНК-плазмиды pF В140 переваривают с 80 ед. ограничительного фермента Eco RI в 200 мкл буфера Eco RI при 37°С в течение 2 ч. Реакционную смесь экстрагируют фенолом, фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола и сушат под вакуумом. Затем ДНК переваривают до конца с 12 ед. ограничительной эндонуклеазы Pst I в 300 мк реакционной смеси, содержащей 6 ммоль/л трис-HCl (рН 7,5), 5ммоль/л MgClt, 50 ммоль/л NaCl, 6 ммоль/л (i-меркаптоэтанола и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (эту смесь называют буфером Pst I) при 37 ;С в течение 2 ч. Фрагмент Pst Т - Eco RI длиной 5,1 тыс. оснований, несущий ген lac 1, очишают электрофорезом

агарозного геля, фрагменты ДНК в агарозном геле подкрашивают бромистым этидием (один микрограмм/мл), и вырезают полосу, соответствующую фрагменту 5,1 тыс. оснований. Фрагменты ДНК в этой полосе элюируют из геля после замораживания. Бромистый этидий удаляют из фрагментов ДНК фенольной экстракцией, и ДНК выделяют осаждением этанолом.

Чтобы клонировать фрагмент Pst I Eco RI длиной 5,1 тыс, оснований, содержащий ген lac 1 в pBR 322, сначала осуществляют делецию меньшего фрагмента ДНК, лежащую между сайтами расщепления Pse I и Eco RI pBR 322

35

40

30 тично переваривают с 0,32 ед. огр ничительного фермента Hind II в 75 мкл буфера Hind III при 37°С в чение 1 ч. После экстракции фенол и осаждения этанолом ДНК сушат по вакуумом Этот способ дает фрагме ДНК различной длины, один из кото рых несет целый ген lac 1.

Чтобы получить вектор-носител для переноса укороченного фрагмен ДНК, несущего ген lac 1, конструи ют плазмиду, обозначенную pV Mill Эту плазмиду можно получить из Е. coli A 221/lac I q/pV Mill, NRRL В-15038, Эту плазмиду получают из

следующим образом: 10 мкг ДНК pBR 322 45 NRRL В-15038 обычными способами.

переваривают с 2 ед, го фермента Pst I в

ограничительно- 100 мкл буфера

pV Mill включает сайт расщепле Нра I, сравнительно близко окруже ный двумя сайтами отщепления Eco Эта плазмида является приемлемым реципиентом для фрагмента гена la поскольку она является членом кла са плазмид, имеющих следующие хар теристики: содержит единственный сайт рестрикции ограничительного

Pst I при 37е

течение 3 ч. После

фенольной экстракции и этанольного осаждения ДНК сущат под вакуумом, а затем переваривают с 80 ед. ограничительно фермента Eco RI в общем объеме 200 мкл буфера Eco RI при 37 С в течение 2 ч. Большие фрагменты Pst I50

pV Mill включает сайт расщепления Нра I, сравнительно близко окруженный двумя сайтами отщепления Eco RI. Эта плазмида является приемлемым реципиентом для фрагмента гена lac 1 поскольку она является членом класса плазмид, имеющих следующие характеристики: содержит единственный сайт рестрикции ограничительного ферEco RI, содержащие примерно 3,7 тыс. ,, мента (т.е. сайт, встречающийся толь J v

оснований, очищают электрофорезом на агарозном геле,

Очищенные фрагменты (0,07 мкг) смешивают затем с О,1 мкг предварико один раз в плазмиде), которьй предпочтительно дает тупые концы, такие как Нра I, Hind II или Pvu II; выведена из pBR 322 и единственный

0

004

0

5

32

тельно полученных фрагментов pF B140 длиной 5,1 тыс. оснований, и цепкие концы Pst I и Eco RI легируют путем обработки 20 ед. Т4 ДНК-лигазы в 25 мкл лигазного буфера, содержащего 0,48 ммоль/л АТФ, при 12,5°С в течение 16 ч. Пятнадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма W 620, гесА Е. coli, NRRL В-15024. Выделяют плазмиду pV М051, NRRL В-15025. Плазмиду получают из NRRL В-15025 обычными способами.

Плазмида pV N051 несет фрагмент ДНК Pst I - Eco RI длиной 5,1 тыс. оснований, содержащий не только ген lac 1, но также и существенную часть гена lac Z. Этот фрагмент содержит три сайта расщепления Hind II в ок- рестности гена lac 1, два из которых окружают или берут в скобки ген

lac 1 и один из которых попадает в сам ген lac 1. Чтобы укоротить этот

фрагмент ДНК длиной 5,1 тыс. оснований и в то же время сохранить ген lac 1 целым для последующего использования, применяют следующую методику: 5 мкг ДНК плазмиды pV K051 час тично переваривают с 0,32 ед. ограничительного фермента Hind II в 75 мкл буфера Hind III при 37°С в течение 1 ч. После экстракции фенолом и осаждения этанолом ДНК сушат под вакуумом Этот способ дает фрагменты ДНК различной длины, один из которых несет целый ген lac 1.

Чтобы получить вектор-носитель для переноса укороченного фрагмента ДНК, несущего ген lac 1, конструируют плазмиду, обозначенную pV Mill. Эту плазмиду можно получить из Е. coli A 221/lac I q/pV Mill, NRRL В-15038, Эту плазмиду получают из

NRRL В-15038 обычными способами.

pV Mill включает сайт расщепления Нра I, сравнительно близко окруженный двумя сайтами отщепления Eco RI. Эта плазмида является приемлемым реципиентом для фрагмента гена lac 1, поскольку она является членом класса плазмид, имеющих следующие характеристики: содержит единственный сайт рестрикции ограничительного фермента (т.е. сайт, встречающийся толь v

ко один раз в плазмиде), которьй предпочтительно дает тупые концы, такие как Нра I, Hind II или Pvu II; выведена из pBR 322 и единственный

33

сайт рестрикции не находится во фрагменте ДНК, который отвечает за копирование самой плазмиды, содержит два сайта рестрикции, окружающих единственный сайт рестрикции и находящихся в пределах примерно 400-700 пар оснований от единственного сайта рестрикции, причем для окружающих сайты рестрикции предпочтительно могу быть узнаны одним и тем же легко доступным ограничительным ферментом, таким как Eco RI, Hind III, Bam HI, или Pst I, при условии, что ни один из двух окружающих сайтов рестрикции отщепления также не повторяется в пределах гена lac 1.

Плазмида pV Kill является пригодной, поскольку она содержит только один сайт рестрикции Нра I, окруженный в пределах 400-700 пар оснований двумя сайтами рестрикции Eco RI, а также потому, что ген lac 1 сам по себе не содержит никаких сайтов рестрикции Eco RI.

Фрагмент ДНК,несущий ген lac 1, вставляют в плазмиду pV Mill, следующим образом: четыре микрограмма ДНК плазмиды pV Mill переваривают с ед ограничительной эндонуклеазы Нра I в буфере Нра I общим объемом 50 мкл при ЗУ С в течение 1 ч. Провели экстракцию фенолом, после чего ДНК выделяют этанольным осаждением и сушат под вакуумом. Чтобы предотвратить самолегированис обработанных Нра I фрагментов ДНК, высушенные ДНК обрабатывают 0,15 ед. бычьего сывороточного альбумина в полном объеме 100 100 мкл реакционной смеси, содержаще 10 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0) и О,1 ммоль/л ЭДТА (эту реакционную смесь называют буфером бычьего сывороточного альбумина), при 37°С1в течение 45 мин. Фенольные экстракции проводят три раза, чтобы полностью удалить бычий сывороточный альбумин, после чего ДНК выделяют этанопьным осаждением с последующей сушкой под вакуумом.

Чтобы вставить фрагмент ДНК длиной 1,7 тыс. оснований, несущий целый ген lac 1 в pV Mill, 0,1 мкг обработанной Нра I ДНК плазмиды pV Mill смешивают с 0,275 мкг фрагментов ДНК, полученным частичным перевариванием Hind II pV M051, и ДНК легируют 320 ед. Т4 ДНК-лигазы в ли- газном буфере (общий объем 20 мкл),

900434

содержащем 0,6 ммоль/л ЛТФ при 12,5РГ в течение 16 ч. Половину смеси легирования используют для трансформации штамма W 620 rec AE. colt, NRRL В-15024, и трансформанты помещают на поверхность L-чашки, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил- -В-галакJQ тозида (называемого Х-гал).Собирают трансформанты, дающие белые колонии, что указывает на вставление фрагмента Hind II длиной 1,7 тыс. оснований, несущего неповрежденный ген lac 1,

15 в плазмиду pV Mill. Поскольку эта трансформация дает плазмиды, несущие ген lac 1 в двух различных ориента- циях, полученные плазмиды обозначили pV N052 и pV M053.

20 Чтобы еще больше ограничить размер выражаемой плазмиды, а также чтобы исключить возможное ингибиторное действие на выражение гена lac 1 от небольшой части гена lac Z, все еще ос25 тавшегося в плазмиде, осуществляют делецию фрагмента гена lac Z, одновременно сохраняя нетронутым ген lac 1.

Получают способом отщепления огра30 ничительного фермента участка между двумя сайтами рестрикции Eco RI плазмиду pV M053, содержащего ген lac 1. Этот участок вкаючает три сайта расщепления Hind III. Два из этих сай35 тов рестрикции Hind II также узнаются ограничительной эндонуклеазой Нра I. Кроме того, имеются три сайта расщепление MSpI в этом участке, два из которых находятся в фрагменте гена

40 lac Z, а один - в последовательности ДНК, отделяющей 3 конец гена lac 1 от 51 конца фрагмента гена lac Z.

Указанное расположение позволяет легко выделить фрагмент длиной 789

г пар оснований, лежгщий между двумя сайтами рестрикции Нра I. Этот фрагмент можно затем поделить, чтобы получить смесь фрагментов MSpI, один из которых содержит 3 участок гена lac 1, но не содержит гена lac Z. По50

55

следний фрагмент вставляют в правильной ориентации, чтобы реконструировать целостный ген lac 1.

Для осуществления этого 100 мкг ДНК-плазмиды pVM053 переваривают с 60 ед. ограничительного фермента Нра I в 800 мкл буфера Нра I при 37°С в течение 2 ч. Фрагмент длиной 789 пар оснований очищают электрофо35

резом с 5%-ным полиакриламидным ге лем: фрагменты ДНК в полиакриламид- ном геле красят бромистым этидием (один микрограмм/мл) и вырезают полосу, соответствующую фрагменту длиной 789 пар оснований. Фрагменты ДНК в этой полосе элюиругот из геля с помощью электрофореза. Бромистый эти14

дий удаляют из фрагментов ДНК феноль- JQ рают резистентные к ампициллину транс- ной экстракцией, а ДНК выделяют эта- нольным осаждением.

Очищенные фрагменты ДНК длиной 789 пар оснований (1,1 мкг) затем переваривают с 12 ед. ограничительного фермента I в 75 мкл буфера Нра I при 37°С в течение 1 ч. Провели фенольную экстракцию, после чего ДНК выделяют этанольным осаждением и сушат под вакуумом. Фрагменты ДНК затем обрабатывают 2000 ед нуклеазы S 1в полном объеме 150 мкл буфера S I при 20 С в течение 1 ч. Реакцию останавливают путем добавления 15 мкл 500 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0) и 15 мкл 250 ммоль/л ЭДТА, после чего проводят фенольную экстракцию. Чтобы удалить фенол и ионы цинка, смесь

20

25

форманты, дающие белые колонии, что указывает на реконструкцию целостного гена lac 1. Одну из плазмидных ДНК, выделенных из отобранных транс- 15 формантов, обозначают pVM058.

Конечная стадия конструирования первой авторегулируемой стимулируемой выражаемой плазмиды серии pIN-III заключается во вставлении гена lac 1 в pKEN 045 (pIN-II, A-1). Для осуществления этого используют следующую методику: 30 мкг ДНК плазмиды pV M058 переваривают с 100 ед. ограничительного фермента Eco RI в 250 мкл буфера Eco RI при 37°С в течение 1,5 ч, Фрагмент Eco RI длиной 2,4 тыс. оснований очищают электрофорезом на ага- розном геле. Фрагменты ДНК (2,0 мкг) затем обрабатывают 600 ед. нуклеазы SI в полном объеме 150 мкл буфера SI при 20 С в течение 1 ч. Реакцию останавливают путем добавления 15 мкл 500 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0) и 15 мкл 250 ммоль/л ЭДТА, после чего проводят экстракцию фенолом. Чтобы удалить фенол и ионы цинка, смесь экстрагируют эфиром и диализуют против 0,01 SSC при 4°С в течение 1,5 ч дважды, а затем ДНК выделяют этанольным осаждением.

экстрагируют эфиром и диализуют против 0,01 SSC при 4 С в течение 1,5 ч дважды, а затем ДНК выделяют этанольным осаждением.

Десять микрограммов ДНК-плазмиды pV M053 переваривают с 12 ед. ограничительного фермента Нра I в 100 мк буфера Нра I при 37°С в течение одного часа. Фрагмент длиной 8 тыс. оснований очищают электрофорезом с 0,7%-ным агарозным гелем, и ДНК (1,1 мкг) затем обрабатывают 0,12 ед бычьего сывороточного альбумина в 75 мкл буфера бычьего сывороточного альбумина при 37 С в течение одного часа, чтобы предотвратить самолегирование тупых концов Нра I. Фенольную экстракцию проводят три раза, чтобы полностью удалить бычий сывороточный альбумин и ДНК выделяют этанольным осаждением, затем сушат под вакуумом.

Фрагменты Нра I длиной 8 тыс. оснований (0,4 мкг), полученные из pV M053, затем смешивают с 0,05 мкг фрагментов ДНК, полученных в результате MSp I переваривания фрагмента длиной 789 пар оснований из pV M053, и ДНК легируют 400 ед. Т4 ДНК-лигазы в лигазном буфере (полный объем

9004ЗЬ

15 мкл), содержащем 0,8 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Десять микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма W 620 rec AE. coli, NRRL В-15024, и трансформанты помещают на поверхность L-чашки, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл Х-гла. Собирают резистентные к ампициллину транс-

0

5

0

форманты, дающие белые колонии, что указывает на реконструкцию целостного гена lac 1. Одну из плазмидных ДНК, выделенных из отобранных транс- формантов, обозначают pVM058.

Конечная стадия конструирования первой авторегулируемой стимулируемой выражаемой плазмиды серии pIN-III заключается во вставлении гена lac 1 в pKEN 045 (pIN-II, A-1). Для осуществления этого используют следующую методику: 30 мкг ДНК плазмиды pV M058 переваривают с 100 ед. ограничительного фермента Eco RI в 250 мкл буфера Eco RI при 37°С в течение 1,5 ч, Фрагмент Eco RI длиной 2,4 тыс. оснований очищают электрофорезом на ага- розном геле. Фрагменты ДНК (2,0 мкг) затем обрабатывают 600 ед. нуклеазы SI в полном объеме 150 мкл буфера SI при 20 С в течение 1 ч. Реакцию останавливают путем добавления 15 мкл 500 ммоль/л трис-HCl (рН 8,0) и 15 мкл 250 ммоль/л ЭДТА, после чего проводят экстракцию фенолом. Чтобы удалить фенол и ионы цинка, смесь экстрагируют эфиром и диализуют против 0,01 SSC при 4°С в течение 1,5 ч дважды, а затем ДНК выделяют этанольным осаждением.

Десять микрограмм ДНК-плазмиды pKEN 045 частично переваривают с 1 ед. ограничительного фермента Hind II в 751 мкл буфера Hind III при 5 37°С в течение 30 мин. pKEN 045 включает два сайта отщепления Hind II, один из которых является также сайтом отщепления Sal I. Частичное переваривание с ограничительным ферментом Hind II дало смесь линейных фрагментов ДНК, самый длинный из которых был расщеплен только в одном из сайтов расщепления Hind TI. Эти фрагменты (каждый длиной примерно 5,0 тыс. оснований) выделяют электрофорезом на 0,7%-ном агарозном геле.

Линеаризованные ДНК (2,5 мкг) обрабатывают 0,15 ед, бычьего сывороточного альбумина в 50 мкл буфера бычье5

0

0

5

го сывороточного альбумина при .57°О н течение 1 ч, чтобы предотвратить самолегирование тупых концов Hind П Фенольную экстракцию проводят трижды чтобы полностью удалить бычий сывороточный альбумин. ЛИК выделяют эта- нольным осаждением, а затем высушивают под вакуумом.

Фрагменты Eco RT длиной 2,4 тыс, оснований (0,15 мкг), полученные из pV M058, затем смешивают с 0,3 мк фрагментов pKEN 045 длиной 5,0 тыс. оснований и обрабатывают 400 ел. Т4 ДНК-лигазы в 15 мкл лигаэного буфера, содержащего 0,8 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Десять микролитров легированной смеси используют для трансформации Е. coli штамма W 620 recA, NRRL В-15024 и отбирают резистентные к ампициллину трансформанты, используя Х-гал. Появление белых колоний подтвердило вставление гена lac 1 в сайт Hind II расположенный ниже от гена Агчр . Эта трансформация дает плазмиды, несущие ген lac I в двух различных ориентациях. Плазмиды с этой структурой обозначены pV M061 (pIN-III, А- 1).

Есть несколько методов конструирования плазмид pIN-III, соответствующих рамкам считывания А-2 и А-3 Если имеются в наличии копии плазмид А-2 и А-3 серий pIN-I и pIN-IT, то способ включает вставление фрагмента гена lac 1 в плазмиды pKEN 049 (pIN-II, А-2), и pKEN 050 (pTN-II, А-3). В- альтернативном и предпочтительном способе просто требуется использовать меньшие фрагменты Xba I - Eco RI pKEN 049 и pKEN 050 или pKEN 039 (pIN-I, А-2) и pKEN 040 (pIN-I, А-3) вместо меньшего фрагмента ХЪа I Eco RI pV M061 аналогично тому, чтобы получить плазмиды А-2 и А-3 серии pIN-III.

Полагая, что еще нет соответствующих структурных (pIN-I) и стимулируемых (pIN-II) плазмид, можно получит авторегулируемые стимулируемые плазмиды А-2 и А-3 непосредственно из плазмиды pV У061 (А-1). Последовательность ДНК в окрестности сайта расщепления Eco RI pV M061 изменяют, чтобы непосредственно получить структуру плазмид А-2 и А-3 соответственно серии pIN-III. Это наиболее предпочтительный способ конструирования

данных плаямид, поскольку для пего не TIV-J но предварительно конструировать соответствующие плаямиды pTN-1 и pTN-тт.

Кгть также несколько возможностей конструирования pTN-TTI плаямид, содержащих вставочные сайты В и С. Полагая, что уже сконструированы соответствующие pIN-I и pIN-IT плазмиды, их модифицируют, чтобы вставить фрагмент гена lac 1, что наиболее предпочтительно, меньший Фрагмент Xba I - Eco RI pV M061 (pIN-III, A-1)

5 последовательно заменяют меньшими фрагментам Xba I - Eco RT от каждой из структурной или стим лируемой плая- миды В-сайта или С-сайта, что дает в любом случае pIN-III В-сайтовую н С0 сайтовую плазмиды.

Наиболее предпочтительно, однако, конструировать pIN-IIT выражаемые плазмиды без первоначального получения соответствующих плазмид pIN-I

S или pIN-II. В случае вставочного слита В-плазмиду В-I pIN-III получают из плазмиды pKEN 221 путем переваривания ДНК-плазмиды pKEN 221 ограничительным ферментом Fnu 4H-1 с после0 дующим присоединением цепких концов Eco RI к концам полученного фрагмента. Полученный таким образом фрагмент Eco RI затем переваривают с помощью ограничительного фермента Xba I, рас5 щепив фрагмент на два в сайте расщепления ХЪа I, расположенном в 5 -непереводимом участке. Посредством очистки полученного таким образом меньшего фрагмента Xba I - Eco RI и ис0 пользования его вместо меньшего фрагмента Xba I - Eco RT p ; 061 (pIN-III А-1) получают В-1 авторегулнруемый стимулируемый клонируемый вектор-носитель. Полученную плазмиду модифи5 цируют, чтобы получить pTN-III плазмиды, соответствующие рамкам считывания В-2 и В-3 соответственно.

Аналогичным образом можно непосредственно получить pIN-III плазмиQ ды С-сайта без первоначального конструирования соответствующих плазмид pIN-I или pIN-II, В частности, после переваривания ДНК-плазмиды pKEN III ограничительным ферментом Sau ЗА и

е присоединения цепких концов Eco RI к концам полученного фрагмента полученный таким образом фрагмент Eco RT затем переваривают с ограничительным ферментом Xba I, расщепив фрагмеш н,1

два в сайте расщепления ХЪа I (расположенном в 5 -непереводимом участке). Фрагмент ХЪа I - Eco RI, несущий участок сигнального пептида, затем вставляют в сайт ХЪа I - Eco RI плазмиды рМ061, чтобы получить C-f плазмиду pIN-III. Последующей модификацией плазмидной ДНК получают pIN- III плазмиды, соответствующие рамкам считывания С-2 и С-3 соответствено.

Структурный ген, кодирующий гормон человека или другой нужный полипептид, можно выразить в трансформированных бактериальных хозяевах, используя рекомбинантный плазмидный клонируемый вектор-носитель по предлагаемому способу и при этом получить значительные количества нужного полипептида.

Формула изобретения

Способ конструирования вектора pV M061, заключающийся в том, что смесь Hind-Ill фрагментов ДНК штамма Escherichia coli K12 клонируют в А-фаг 2540, отбирают фаг Х 1рр Ее-1, содержащий полный липопротеи- новый ген, субклонируют Hind-Ill фрагмент длиной 2,8 кв данного фага с фосфорилированной Eco RI связкой в плазмиду pS С101, отбирают трансформанты, содержащие плазмиду pKEN III, далее субклонируют Alu I фрагмент размером 0,46 кв плазмиды pKEN в pBR 322, отбирают клоны, содержащие плазмиду pKEN 008, исключают сайт Eco RI в pKEN 008, среди

Редактор В.Данко

Составитель Н.Кузенкова Техред Л.Сердюкова

Заказ 2378/58

Тираж 501

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

5

- рансформантов IE 559 Е, coli NRRL В-15104 отбирают клоны, содержащие плазмиду pKEN 010, клонируют фраг- . мент с фосфорилированной Sal I - связкой плазмиды pKEN TTI длиной 0,95 кв, кодирующий 3 -непереводимый участок и сайт окончания транскрипции 1рр гена в плазмиду pKEN 014, предварительно полученную из плазмиды pBR 322 делецией Hind-III - Bam HI фрагмента длиной 0,35 кв, получают рекомбинантную плазмиду pKEN 018, далее соединяют фрагмент липо- протеинового промотора с фрагментом окончания транскрипции, для этого заменяют Pvul - Eco RI фрагмент размером 0,65 кв плазмиды pKEN 018 на фрагмент Pvu I - Eco RI размером 1,1 кв плазмиды pKEN 010, полученную плазмиду pKEN 0,21 модифицируют, вставив Hind III сайт между существующими сайтами Eco RI и Ват HI, промотор-оператор lac uv 5 клонируют в ХЬа I сайт плазмиды pKEN 037, в полученной плазмиде pKEN 038 удаляют ХЬа I сайт, отбирают amp - клоны, содержащие pKEN 045, после чего клонируют lac 1 ген в плазмиду

0 pVM III, выделяют плазмиду pVW 052 и pVM 053, производят делецию фрагмента гена lac Z, сохраняя нетронутым ген lac 1 в плазмиде pVM 0,53. связывают Eco RI фрагмент размером 2,4 кв полученной плазмиды pVM 058 с Hind III фрагментом размером 5,0 кв плазмиды pVM 045 и выделяют конечную векторную плазмиду pVM 061 из трансформированных клонов штамма бактерий

0 Е. coli NRRL В-15024.

0

5

Корректор С.Шекмар

Подписное