Способ изготовления диагностического средства для определения лактатдегидрогеназы в биологических жидкостях Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/32 G01N33/48 

:

Изобретение относится к медицине, точнее к способам получения средства для обнаружения повышенной концентрации лактатдегидрогеназы. Цель изобретения - повышение диагностической точности средства. Для этого готовят водный р-р из следующих компонентов, мг п-нитроблаунитрозолий- хлорид (0,490), гидрохлорид триэтано- ламина 49,00, ацетат натрия 18,500, НАВ(аденозин 5 -тpигидpoдифocфaт З -(5 -эфир с гидроокисью 3-)амино- карбонил (-1-р-П-рибофуранозил-ш1ри- дина, внутренняя соль) 2, фенацин- метасульфат 0,049, вода очищенная ,961. Добавляя 3 н.НС устанавливают рН р-ра равной 3, смесь наносят на гигиенический тампон, находящийся в оболочке из сополимера винип- хлорида и поливинипиденхлорида. . 2 з.п. ф-лы, 2 табл. О)

см

Изобретение относится к медицине, астности к способам получения едства для обнаружения повьппенной нцентрации лактатдегидрогеназы. 5

Цель изобретения - повьпиение диностической точности средства.

Пример 1. Готовят водный равор из укаэанньгх ниже компонентов. азанные количества наносят соответ-10 венно на тампон.

Состав раствора следующий, мг:

п-Нитробляунитрозолийхлорид

Гидрохлорид триэтаноламина

Натрий ацетат

NAD(aдeнoзин

5 -тригидродифосфат) 5(5 -эфир с гидрокисью 3-)аминокарбонил (-1-/}- D-pибoфypaнoзил0,490

49,000 18,500

15

20

пиридина, внутренняя соль) Фенахшнметасульфат Вода очищенная

2,000

0,049

1948,961

2019,000

Соответствует 2,00 мл.

Добавлением 3 н.соляной кислоты устанавливают рН-3 и затем в количестве 2,00 мл смесь наносят на обыч- ньш гигиенический тампон, который находится в упаковочной коробочке с внутренним покрытием из химически инерционной пленки, состоящей из сополимера винилхлорида и поливинил- вденхлорида. Эта оболочка в свою оче редь находится в алюминиевой трубочк

Всю систему высушивают при замора .живании. Непосредственно после этого алюминиевую трубочку закрывают в ва- кууме резиновой пробкой. Алюминиевую трубочку открывают лишь непосредственно перед применением содержащегся в ней диагностического средства,

которое вынимают.

П р и м е р 2. Готовят водный раствор из компонентов, указанных в

примере 1.

Затем добавлением 3 н,соляной кислоты устанавливают рН - 4,9 и поступают, как описано в примере 1.

Полученное таким образом диагностическое средство дает такой же положительный эффект.

5

0

5

30

35 40 .

45 Диагностическое средство предназначено для распознавания патологических состояний организма путем выявления с его помощью повышенных концентраций лактатдегидрогеназы во внеклеточных жидкостях. Так могут быть установлены раковые заболевания женских органов, а также могут быть определены инфекции, взыванные бактериями, паразитами, грибами. При серийных исследованиях с гистологически определенными карциномами в гениталь- ной области на стадиях 1 и IV только 10% диагнозов оказались неправильными. Средство в виде тампона, применяемое для исследования внутри тела, например во влагалище, не вызывает раздражения слизистое оболочки, при этом перехода красителя на слизистую и другие ткани не происходит и не вызывает побочных реакций внутри и на теле исследуемого пациента.

В отсутствии носителя полярными группами окрашивания смеси не происходит. Исследованию могут подвергаться: влагалищный секрет, сыворотка крови, желудочный и кишечный сок, желчь, выделения бронхов, простаты,

уретры.

В качестве субстрата в средстве предпочтителен лактат натрия, но может использоваться лактат калия или

кальция.

В качестве буферной системы используют триэтаноламингидрохлорид или эквивалентную смесь триэтаноламина и соляной кислоты.

в качестве красителя используют

соли тетразолия, бензидиновые красители, индофенолы.

Соединением, передающим водород, могут быть фенозинметасульфат, диафоразен, менадион, мелдола-блау. Опытные данные об испытаниях различных носителей приведены в табл. 1.

Таблица

Носители имели следующие химические строения.

Шерсть: полипептид из различных аминокислот. Главная составная част шерсти - кератин:

н н

I I

NH- C-CO- NH- С- СО- II

-RI

Полиакрилонитрил -полимерное волокно следующей структуры:

- СН2- сн- сн - СН2-

CN CN

Полиамид 6,6 (найлон): .поликонденсат со структурой амида кислоты (белковая связь) из гексаметилендиа- мина и адапиновой кислоты следующей структуры:

--NH- (СНг)-Ш- C-CCH X- С О О

Регенерат целлюлозы. Различие в вискозных волокнах лежит лишь в гистологическом строении волокон. Функциональными группами являются гидооксильные, ацетальные, альдегидные и кар- 4Ь створа аскорбата натрия проводили боксильные группы.реакцию, протекающую как при примеПолиакрилонитрил (дунова): различие нении средства в соответствии с изоб- для обычных полиакриловых волоконретением в случае положительного ди(дралона) лежит в строении волокна.агноза (образование красителя),

функциональными группами являются та- 50 Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

5

0

5

0

кие группы, как в случае полиакрило- нитрила. Полиэфиры - поликонденсатные волокна с сложноэфирными группами ди- карбоновых кислот и двувалентных спиртов, и соответствуют, например, следующей структуре:

- О - СНг,- СНо- о - С II II

о о -

Используемые волокнистые носители зкстрагировали в течение 10 мин при 35 С метиленхлоридом.

Из экстрагированных волокон приблизительно одинаковые количества помещали в реакционный сосуд и смешивали с 1 мл индикаторного раствора , следующего состава, мг:

п-Нитроблаутетразолийхлорид

Гидрохлорид

триэтаноламина

Ацетат натрия

ЫАВ(аденозин 5 дигидрофосфат)5(5 -эфир с 3-)аминокарбонил (1-/ь-1рибофуранозил-пиридинийгидроксидом,

внутренняя соль)

Фенацинметасульфат

Вода очищенная

0,490

49,000 18,500

2,000 0,049 1948,961

2019,000

35 Соответствует 2,00 мл.

Раствор, добавлением 3 н. соляной кислоты, устанавливают на значении рН 4,4-4,6. Пробы носителей, приготовленные с полученным индикаторным

40 раствором, вымораживали в течение 2 в морозильном шкафу и затем высушивали вымораживанием в течение 17 ч. Затем в заключение в результате добавления соответственно 1 мл 1 М раUA90126

Продолжение табл.2

1 1-

..Т.

Полиакрилонитрил (драпон)

Полиамид 6.6(найлон)

Полийозик (модифицированнаяцеллюлоза)

Полиакрил (дуно- ва)

Полиэфир (диолен)

в табл. 2 в графе смачивание указаны цифровые значения, которые .дают ступень смачиваемости носителя индикаторным раствором при визуальной оценке. Шкапа оценки принята от 1 (очень хорошо) до 5 (недостаточно).

Для определения прочности окраски или степени фиксирования образующегося на волокне кpacиteля (ди- формазана) на соответствующем носите ле испытывали окрашенные пробы следующим образом:

а)пробы промывали в моющей ванне при соотношении 1:40, т.е. 1 г носителя в 40 мл жидкости, при /и и в течение 5 мин, После этого визуально оценивали соответствующее помутнение или окрашивание воды;

б)пробы были промыты метиленхло- ридом или хлороформом окрашивание растворителя также оценивали визуально.

Результаты, полученные в пунктах а и б, даны дополнительно в табл.3. ТаблицаЗ

Белок (шерсть)Прозрач- Слегка синий ная 2 2

Прозряч- Слегка синий ная 3 1-2

Прозрач- Слегка синий ная 4 3

..Т.

3-5

1-2

5-8

3-5

4-6

1

2 2-3

:Е

Продолжение табл.3

3

Прознач- Слегка синий ная 11-2

Прозрачт Слегка синий ная 3 3-4

5

0

5

50

При применении хлороформа в ка- чесггве растворителя в основном получают такие же результаты, как в случае метиленхлорида.

Как видно из табл. 3, краситель диформазан глубоко фиксируется на волокнах. В то время, как при обработке водой смывается лишь незафиксированный диформазан, метиленхпо- ридом или хлороформом он частично растворяется. В результате этого следует также подкрашивание органического растворителя.

В табл. 3 в графах вода и метиленхлорид указаны цифровые значения, которые соответствуют количеству незафиксированного красителя (в случае воды смываемого с волокна красителя, в случае органического растворителя красителя, перешедшего в раствор). С увеличением числовых значений количество смьюа- емого или растворенного красителя увеличивается.

Во всех случаях испытаний прочности окраски носитель имел темно- синее окрашивание, т.е. краситель

7144901

был Чрезвычайно прочно зафиксирован на носителе.

Как видно из результатов опытов, все исследованные носители пригодны с для применения средства в соответствии с изобретением.

Формула изобретения

t. Способ изготовления диагностического средства для определения лактат- дегидрогеназы в биологических жид- костях, включающий растворение окислительно-восстановительного крайите- |ЛЯ, буферной системы, никотинамид- аденин-динуклеотида, соединения,. передающего водород, и лактата, коррекцию рН полученной смеси, нанесе

28

ния этой смеси на носитель, связывающий окислительно-восстановительный краситель, отличающийся тем, что, с целью повьппения диагностической точйости средства, используют носитель, имеющий полярные группы, а рН смеси корректируют в диапазоне 3,0-4,9.

3.Способ попп. 1и2, отличающийся тем, что буферную систему используют в виде триэтанола- мингидрохлорида или в форме несте- хиометрической смеси из триэтанола- мина и хлористого водорода.