Способ получения ноурзеотрицина Советский патент 1991 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/57 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу ферментативного получения антибиотика нуорзеотрицина, имеющего эргот- ропное действие, а в то же время и важное экономическое значение для сельского хозяйства и фармацевтической промышленности.

Известен способ получения ноурзеотрицина, предусматривающий культивирование штамма Streptomyces noursei IA 3890 Ьв глубинных аэробных условиях (патент ГДР № WP А 61 К/223321, кл, Н 04 R 17/00. 1983).

Однако в данном способе используют ингибиторы дыхательной цепи типа щелочных азидов, бренцкатехинов и/или амиталя, а также веществ, ингибирующих перенос аминокислот.

В публикации()„ BockerH., Reinhard G. und Thrum H. Regulative Beeinflussung des Nourseothricinbiosymhese durch o-Ammo benzoesa ure in Kuituren des Streptomyces nourse IA3890b.-Z. Allg. Mikrobio; 1974, 14, 659 - 673) описывается питательная среда, в которой кукурузный крахмал используется в качестве источника углерода. В этом процессе с использованием исходного штамма Streptomyces noursei IA 3890 bio- жес прибавлением ингибиторов названных типов и ингибиторов, описываемых в описании к патенту WP A 61 К/223321, достигается настолько незначительный выход ноурзеотрицина, что экономическое производство оказывается невозможным.

С

О

о

4 Ю

Цель изобретения - получение ноурзе- отрицина достаточно эффективным способом на малогексозных, в частности малоглюкозных, питательных средах. В основу изобретения положена задача представить удобный в техническом отношении способ, который позволяет осуществить промышленное производство ноурзеотри- цина посредством мэлогексозного, димер-, олигомер-или полимерсодержащего источника углерода в -питательной среде. .

Найдено, что определенные ноурзеот- рицинопродуцирующив штаммы, отличающиеся достаточной амилолитической активностью, с использованием крахмала в качестве первичного малогексозного полимерного источника углеводов накапливают в питательной среде большие количества поурзеотрицина. Эти штаммы накапливают ноурзеотрицин в таких больших количествах также без прибавления ингибиторов дыхательной цепи и, соответственно, переноса аминокислот. Такие результаты получены, например, на ноурзеотрицинопро- дуцирующих штаммах, депонированных в коллекции Института под номером ZIMET 43700, ZIMET 43701 H°ZIMET 43708.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Вегетативный посевной материал используемого ноурзеотрицинообразующего штамма, который получен путем выращивания в нескольких стадиях из консервированного мицелия, служит для засева ферментационных питательных сред.

Среды имеют следующий основной состав:

крахмал, в частности кукурузный, в качестве основного источника углеводов в количестве 50 - 150 г на 1 л;

комплексные источники азота в виде арахисного шрота или соевого шрота в количестве 5 - 25 г на 1 л и/или кукурузный экстракт в количестве 1 - 10 г на 1 л;

неорганический источник азота, например сульфат аммония в количестве 5 - 15 г на 1 л;

карбонат кальция, например в виде мела, в количестве 4 - 20 г на 1 л;

пеногаситель, например пеногаситель на силиконовой или полиэтиленовой основе или/и растительные жиры.

В течение 72 - 196-часовой ферментации при температурах 28 - 30°С с дополнительным прибавлением и без него ожиженных концентрированных полимерных источников углеводов с использованием ферментных препаратов с амилолитической активностью, например пивоваренного фермента, а также при поддержании кислотности культуральной жидкости прибавлением 25%-ного раствора гидроокиси аммония на уровне рН 5,0 - 8,0, предпочтительно при рН 5,5 - 6,5, достигается высокая концентрация ноурзеотрици- на в культуральной жидкости.

Выделение и очистку ноурзеотрицина проводят известным путем.

П р и м е р 1. Из консервированного

0 мицелия штамма Streptomyces noursel ZIMET 43700 выращивают предварительные культуры в широкогорлых колбах емкостью 500 мл и 100 мл и, соответственно, в колбах Эрленмейера емкостью 2,5 л по 400

5 мл питательной среды, имеющей следующий состав: в 1 л водопроводной воды содержится 15 г арахисового шрота, 10 г кукурузного экстракта 100% сухого вещества, 40 г мальтозы, 5 г сульфата аммония, 6 г

0 карбоната кальция. Устанавливают перед стерилизацией рН 6,5 - 6,8. Стерилизацию проводят в течение 35 мин при 121°С.

Культуру первого пассажа культивируют в течение 48 ч при 29 - 30°С на круговой

5 качалке. После получения достаточного количества мицелия по 20 мл суспензии пред- варительной культуры используют в качестве посевного материала для второго пассажа и выращивают в течение 24 ч в тех

0 же условиях.

Для засева 10 л питательной жидкости в 15-литровом ферментаторе используют содержимое двух колб второго пассажа культивирования. Состав питательной сре5 ды следующий: на 1 л водопроводной воды берут 80 г кукурузного крахмала. 25 г арахисового шрота, 10 г кукурузного экстракта. 10 г сульфата аммония, 3 г подсолнечного масла, 5 г мела острова Рюген. Устанавлива0 ют перед стерилизацией рН 6,8 - 7,0. Стерилизацию проводят в течение 30 мин при 121°С. Во время ферментации дважды прибавляют по 300 г крахмала (после обработки известным образом пивоваренным

5 ферментом). Кислотность ферментационного раствора поддерживают постоянной на уровне рН 6,2 при помощи гидроокиси аммония. По окончании 144-часовой ферментации с числом оборотов 360 об/мин и

0 скоростью аэрации 0,75 об/об/мин получают 7,2 г ноурзеотрицина на 1 л культуральной жидкости.

Пример 2. В две колбы на качалке (2,5 л), содержащие каждая по 400 мл питатель5 ной среды, засевзют по 0,5 мл суспензии консервированного мицелия штамма S.noursei ZIMET 43701 и культивируют в течение 48 ч при 29°С на круговой качалке. Питательная среда имеет следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 15 г

кукурузного крахмала, 15 г соевого шрота, 0,3 г дигидрофосфата калия, 5 г хлорида натрия, 1 г карбоната кальция, Уста на вливают перед стерилизацией рН 6,5 - 6,8. Стерилизацию проводят в течение 30 мин при 121°С.

Соединенное содержимое первых предварительных культур используют для засева 250-литрового посевного ферментатора, содержащего 150 л питательной среды такого же состава, как у первой предварительной культуры. Культивирование осуществляют в течение 40 ч при 29°С с числом оборотов 240 об/мин и скоростью аэрации 0,5 об/об/мин, 45 л полученной посевной культуры (6,8 - 7,0) используют в качестве инокулюма для засева 400 л питательной среды в 720-литровом ферментаторе. Культивирование производят при скорости аэрации 1,0 об/об/мин и числе оборотов 320об/мин при29°С. Кислотность культуры автоматически поддерживают постоянной на уровне 6,2 прибавлением 25%-ного раствора гидроокиси аммония.

Питательная среда имеет следующий состав:на 1 л водопроводной воды приходится 60 г кукурузного крахмала, 10 г арахисового шрота, 2 г кукурузного экстракта, 8 г сульфата аммония, 0,05 г сульфата цинка, 0.03 г сульфата марганца, 0,5 г подсолнечного масла, 3,75 г мела острова Рюген. Кислотность питательной среды устанавливают перед стерилизацией 6,8 - 7,0. Стерилизацию производят острым паром при 120°С в течение 30 мин. В процессе ферментации, т.е. на 30, 45, 70, 100, 120 ч, прибавляют к среде по 6 кг кукурузного крахмала, ожиженного пивоваренным ферментом до концентрированного раствора (около 30%- ного). После 120-часовой ферментации получают 550 л культуральной жидкости, которая содержит ноурзеотрицин в концентрации 6,53 г на 1 л.

П р и м е р 3. Для выращивания посевного материала лиофилизированный на глюкозожелатине высушенный консервированный мицелий (вес брутто около 300 кг) штамма S. noursel ZIMET суспендируют в 3 мл физиологического раствора пивоваренной соли, 0,5 мл питательной среды первого пассажа. Питательная среда имеет следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 40 г глюкозы, 15 г соевого шрота, 0,3 г гидрофосфата калия, 5 г хлорида натрия, 3 г карбоната кальция. Перед стерилизацией устанавливают рН среды 6,5. По 400 мл этой среды заливают в закрываемые ватной пробкой широкогорлые колбы емкостью 2,5 л. Стерилизацию проводят в автоклаве при 120°С в течение 35 мин. Засеянные культуры инкубируют на круговых качалках при 29°С в течение 48 ч. 800 мл получаемой культуральной жидкости первого пассажа используют для второго пассажа - для за- сева 180 л среды, стерилизованной паром (45 мин при 120°С), такого же состава, как в первом пассаже, содержащейся в ферментаторе из высококачественной стали (общий объем 250 л). Культивирование

0 осуществляют в течение 40 ч (рН 5,1 - 5,3) при 28 - 29°С, числе оборотов 240 об/мин и скорости аэрации 1,0 об/об/мин. Для основной культуры используют ферментатор из высококачественной стали (общий объем

5 4200 л), наполненный 2500 л питательной среды, имеющей следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 62,5 г кукурузного крахмала. 2,5 г глюкозы, 12г соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 г сульфата

0 магния. 1 г хлорида натрия, 6 г карбоната кальция. 0,5 г сульфата цинка, 0,5 г полипро- пиленгликоля.

Кислотность среды устанавливают перед стерилизацией 6,2 , Стерилизацию пи5 тательной среды (без глюкозного компонента) проводят in situ путем предварительного нагрева паром рубашки до 75°С и последующего нагрева острым паром до 120°С в течение 15 мин. После охлаждения

0 до 29°С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно простерилизованную в виде 40%-ного водного раствора нагревом до 120°С в течение 30 мин. Перед засевом устанавливают серной кислотой

5 исходную кислотность питательной среды 6.8 + 0,1.

Засеянную 4% инокулюма второго пассажа ферментационную среду основной культуры культивируют в течение 140 ч при

0 29°С, скорости аэрации 0,5 об/об/мин (0 - 20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20 - 140-й часы) и при избыточном давлении 0,03 МПа при перемешивании с числом оборотов 180 об/мин. Кислотность культуральной жидко5 сти поддерживают постоянной 25%-ным раствором гидроокиси аммония на уровне 6,0+0,1 после физиологически обусловленного медленного снижения исходного значения рН.

0 В результате биологического теста в культуральной жидкости определены следующие количества продукта (см.табл.1).

П р и м е р 4. Предварительное культивирование производят по примеру 3 с ис5 пользованием штамма ZIMET 43708. Для основной культуры используют ферментатор из высококачественной стали (общий объем 720 л), который наполнен 500 л питательной среды, имеющей следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 62,5

г кукурузного крахмала, 2,5 г глюкозы, 12 г соевого шрота, 11г сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, б г карбоната кальция, 0,1 г сульфата железа (III), 0,5 г полипропиленгликоля. Кислотность раствора устанавливают перед стерилизацией 6,2. Стерилизацию питательной среды (без глюкозного компонента) проводят In situ предварительным нагревом паром рубашки до 75°С и последующим нагревом острым паром до 120°С в течение 15 мин. После охлаждения до 29°С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раз- дельно простерилизованную в форме 50%-кого водного раствора нагревом до 120°С в течение 30 мин. Перед засевом при помощи серной кислоты производят установку начальной кислотности питательной среды 6,8jt0.1. Засеянную 4% инокулюма второго пассажа ферментационную среду основной культуры культивируют в течение 116ч при 29°С, скорости аэрации 0.5 об/об/мин (0 - 20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20 - 116-й часы) при избыточном давлении 0,03 МПа и перемешивании с числом оборотов 320 об/мин. Кислотность культураль- ной жидкости поддерживают постоянной 25%-ным раствором гидробкиси аммония на уровне 6,0±0,2 после физиологически обусловленного медленного снижения начального значения рН.

В результате биологического теста в культуральной жидкости определены следующие концентрации продукта (см.табл.2.).

П р и м е р 5. Предварительное культивирование проводят по примеру 3 и используют штамм 43708.

Для основной культуры используют ферментатор из высококачественной стали (общий объем 450 л), который наполнен 300 л питательной среды, имеющей следующий состав: на 1 л водопроводной воды берут 120 г кукурузного крахмала; 5 г глюкозы, 24 г соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, 6 г карбоната кальция, 0,5 г сульфата цинка, и 0,5 г полипропиленгликоля.

Для ожижения большой доли полимерного источника углеводов используют известным образом пивоваренный фермент.. После энзиматического гидролиза крахмала вливают остаточные компоненты питательной среды. Стерилизацию питательной среды осуществляют нагревом до 120°С в течение 15 мин. После охлаждения до рабочей температуры перед засевом при помощи серной кислоты устанавливают кислотность питательной среды 6,8+0,1. Засеянную 4% инокулюма второго пассажа

культивирования ферментационную культуру культивируют в течение 124 ч при 29°С, скорости аэрации 0,5 об/об/мин (0 - 20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20 - 124-й часы) при

избыточном давлении 0,03 МПа при перемешивании с числом оборотов 400 об/мин.

К 16-му часу ферментации прибавляют 2 мг.л источник фосфора (например, ди- гидрофосфат калия) в форме стерилизован0 кого водного раствора. Кислотность культуральной жидкости (рН) поддерживают постоянной на уровне 6,0 + 0,2 при помощи 25%-ного раствора гидроокиси аммония после физиологически обуслов5 ленного медленного снижения начального значения рН.

В результате биологического теста в культуральной жидкости определяют следующие концентрации продукта (см.табл.З).

0 Примерб. Предварительное культивирование проводят по примеру 3, используют штамм 43708.

Питательная среда и ее приготовление идентичны представленным в примере 3. Ис5 пользуют два ферментатора из высококачественной стали (общий объем 720 л), каждый из которых наполнен 500 л питательной среды.

Количество инокулюма и режим процесса соответствуют условиям, пред став0 ленным в примере 3. В ферментационную среду на 12-м часу ферментации добавляют 10 ми источника фосфора (как дигидро- фосфат калия) в форме стерилизованного водного раствора. Другая ферментацион5 ная среда добавок не содержит.

В результате биологического теста в культуральных жидкостях определены концентрации ноурзеотрицина, увеличивающиеся с различной скоростью (см.таЬл.4).

0 Пример. Предварительное культивирование проводят по примеру 3, используют штамм ZfMET 43708.

Для основной культуры используют ферментатор из высококачественной стали

5 (общий объем 720 л), который наполнен 500 л питательной среды, имеющей следующий состав: из расчета на 1 л водопроводной воды берут 62,5 г кукурузного крахмала, 2.5 г глюкозы, 16 г соевого шрота, 11 г сульфата

0 аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, 6 г карбоната кальция, 0,13 г сульфата-гидрата алюминия, 0,5 г полипропиленгликоля. Кислотность раствора устанавливают перед стерилизацией 6,2.

5 Стерилизацию осуществляют нагревом до 120°С в течение 15 мин. После охлаждения до 29°С перед засевом устанавливают начальную кислотность-питательной среды (рН) серной кислотой 6,8 ± 0,1. Основную ферментационную среду, засеянную 4%

инокулюма второго пассажа культивирования, культивируют в течение 116ч при температуре до 29°С. скорости аэрации 0,5 об/об/мин (0 - 20-й часы) или 1,0 об/об/мин (20-116-й часы) при избыточном давлении 0,03 МПа и перемешивании с числом оборотов 320 об/мин. Кислотность культуральной жидкости поддерживают постоянной 25%-ным раствором гидроокиси аммония на уровне 6,010,3 после физиологически обусловленного медленного снижения начального значения рН.

В результате биологического теста в культуральной жидкости определены следующие концентрации продукта (см.табл.5).

П р и м е р 8. Выращивание продукта S.noursel ZIMET 43716 осуществляют по примеру 1. Для засева 15-литрового ферментатора, заполненного 10 л питательной среды, используют содержимое двух колб 2-й фазы культивирования. Питательная среда содержит в 1 л водопроводной воды 60 г картофельного крахмала, 5 г глюкозы, 10 г экстракта соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 г сульфата магния. 1 г хлористого натрия, 6 г карбоната кальция, 0,5 г сульфата цинка. Стерилизацию осуществляют в течение 30 мин при 121°С, рН поддерживают постоянной на уровне 6,2 гидроокисью аммония. Через 144 ч ферментации при числе оборотов 360 об/мин, скорости аэрации 0,75 об/об/мин и температуре 28 - 30°С образуется 2,1 г но- урзеотрицина на 1 л культуральной жидко- сти.

П р и м е р 9. Осуществляют способ в соответствии с примером 8 с использованием штамма 43708. Из питательной среды

0

5

0 5 0 5

0

исключают сульфат цинка. Через 144 ч ферментации образуется 6,5 г/л антибиотика.

П р и м е р 10. Осуществляют способ в соответствии с примером 8 с использованием штамма 43708. Выращивание проводят в питательной среде, содержащей в 1 л водопроводной воды 80 г пшеничной муки, 5 г глюкозы, 10 г экстракта соевого шрота, 11 г сульфата аммония, 2 г сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 6 г карбоната кальция. Через 144 ч ферментации образуется 6,9 г/л антибиотика.

Формула изобретения

1.Способ получения ноурзеотрицина путем выращивания продуцента вида Streptomyces noursel в глубинных аэробных условиях в питательной среде, содержащей источник азота, углевод и минеральные соли, при температуре 28 - 32°С и поддержании кислотности культуральной жидкости в пределах рН 5,0 - 7,0, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Streptomyces noursei ZIMET 33700, ZIMET 43701 или ZIMET 43708. в качестве углевода в питательной среде используют кукурузный крахмал, картофельный крахмал или пшеничную муку и культивирование ведут в течение 68 - 144 ч.

2.Способ по п.1,отличающийся тем, что осуществляют разовое выделение углевода.

3.Способ по пп.1 и 2, отличающий- с я тем, что осуществляют дополнительную дробную подачу углевода.

4.Способ по пп.1 -3, отличающий- с я тем. что кукурузный крахмал вводят после предварительной ферментативной обработки.

Таблица 1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частносы к производству антибиотиков Штамм Streptomyces noursei 33700, ZIMbT 43701 или ZIMET 43708 культивируют в ферментационной среде, которая в качестве источника углевода содержит кукурузный крахмал, картофельный крахмал и пшеничную муку, в глубинных аэробных условиях при 28 - 32°С. В процессе ферментации поддерживают величину рН на уровне 5,0 - 7,0. Продолжительность процесса 68 - 144 ч. Введение углевода разовое или дробное Выход ноурзеотрицина от 6 до 15 г/л куль- туральной жидкости. 3 з.л. ф-лы, 5 табл

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5