Способ определения верографина в растворах и биологических жидкостях Советский патент 1992 года по МПК G01N21/78 

fc

Изобретение касается аналитической химии,в частности определения верографина в растворах и биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности анализа. Его ведут осаждением белка трихлоруксусной кислотой с последующим отделением осадка, кипячением надосадочной жидкости в присутствии соляной кислоты, обработкой полученного раствора сначала нитритом натрия, а затем Ы-(1)-нафтилэтилендиаминди- гидробромидом и фотометрированием полученного раствора при длине волны 500 нм. Эти условия повышают специфичность анализа и его чувствительность с 3,18 до 0,05 мг. 4 табл.

Изобретение относится к биохимии, а именно к методам определения лекарственных препаратов в растворах и биологических жидкостях, и касается способа определения верографина (СПО- ФА, ЧССР) - производного 3,5-диацетила- мина-2,4,6-трий од бензойной кислоты, которое используется как диагностическое рентгеноконтрастное средство, а также для выделения отдельных типов клеток крови, в частности лимфоцитов.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности определения.

Способ осуществляется следующим образом.

0,25 мл испытуемой пробы вносят в центрифужную пробирку с 0,5 мл дистиллированной воды (если предполагают высокую концентрацию вещества, то разводят в

большей степени), добавляют 0,25 мл 20% трихлоруксусной (ТХУ) кислоты, если образуется осадок центрифугируют и отсасываю т 0,5 мл центрифугата, который подкисляют 0,1 мл 4н. HCI, закрывают фольгой и гидро- лизуют на кипящей водяной бане в течение 60 мин, затем охлаждают в холодильнике при 4°С 30 мин, приливают 0,1 мл 0,2% свежеприготовленного NaN02, через 4 мин - 0,1 мл 1 % аммония сульфа- миновокислого, через 2 мин - 0,2 мл 0,01 % N- -(1)-нафтилэтилендиаминдигидробромида (НЭД).

Пробы оставляют стоять в темноте в течение 30 мин. После каждого прибавления реагентов и при оставлении в темноте пробы встряхивают для развития окраски. Затем фотометрируют на МКМФ в кювете объемом 1 см при толщине слоя 1 см и длине волны 500 нм.

00

о о о

Пример. 0,25 мл раствора, содержащего около 100 мкг верографина приливают в центрифужную пробирку с 0,5 мл дистиллированной воды, затем добавляют 0,25 мл 20% ТХУ, перемешивают и центри- фугируют. Отсасывают 0,5 супернатанта в обычную пробирку, приливают 0,1 мл 4 н. HCI, закрывают фольгой и гидролизуют на кипящей водяной бане в течение 60 мин, охлаждают в холодильнике 30 мин, прили- вают 0,1 мл 0,2% свежеприготовленного нитрита натрия, через 4 мин - 0,1 мл 1% аммония сульфаминово кислого (АМС), через 2 мин - 0,2 мл 0,01% НЭД. Пробы оставляют в темноте на 30 мин, периоди- чески встряхивают, Через 30 мин фотомет- рируют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500 нм.

П р и м е р 2. 0,25 мл сыворотки вносят в центрифужную пробирку с 0,05 мл дистиллированной воды, добавляют 0,25 мл 20% ТХУ, центрифугируют, отсасывают 0,5 супернатанта и обрабатывают как указано в примере 1.

П р и м е р 3. 0,25 мл мочи, разведенной в 5 раз, вносят в центрифужную пробирку с 0,5 мл дистиллированной воды, перемешивают, центрифугируют. Отсасывают 0,5 супернатанта и обрабатывают как указано в примере 1.

В табл. представлены данные, полученные при определении верографина способом нитрования без гидролиза и с гидролизом,

В табл.2 представлены данные, подтверждающие влияние времени гидролиза на определение верографина; в табл.3 - спектры поглощения света азопроизвод- ным верографина; в табл.4 - данные, показывающие влияние времени азосочетания на изменение оптической плотности раствора.

Данный способ позволяет повысить специфичность определения и чувствительность до 0,05 мг, т.е. в 63,6 раза по сравнению с известным способом.

Формула изобретения Способ определения верографина в растворах и биологических жидкостях путем осаждения белка трихлоруксусной кислотой, отделения осадка, обработки надоса- дочной жидкости нитритом натрия, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности определения, перед обработкой нитритом натрия надосадочную жидкость кипятят в присутствии соляной кислоты, полученный раствор обрабатывают Ы-(1)-нафтилэтилендиамин- дигидробромидом и фотометрируют при длине волны 500 нм.

Таблица 1

Примечание

Наибольшая полнота гидролиза с сохранением количественной зависимости отмечается при сроке 60 мин.

Примечание. Максимум поглощения при 500 нм.

Раствор верогра

фина100

дистиллированная (контроль)

Сыворотка, содержащая верографин 100

Сыворотка без

верографина

.контроль)

Моча (1:5), содержащая верографин 100

Моча (1:5) без

верографина

(контроль)

0,11510,0000,11b±0,0010,115iO,0000,115±0,000

0,007±0,00l40,010±0,00&0,012+0,0020,010+0,000

0,,0000,13510,0000,133+0,003

0,01510,0000,020+0,0000,025±0,0000,025±0,000

0,136+0,0290,197±0,0280,200±0,025

0,09510,0000,099iO,0000,05±0,0000,103±0,001

Примечай и е. Окраска полностью развивается через 30 мин, в дальнейшее время не происходит достоверного увеличения оптической плотности.

25

Таблица k